miRNAs及血清神经元PAS结构域蛋白4、NSE、S100β蛋白水平对急性脑血管病患者认知障碍的影响

周璇，薛艺东，郭杰

【摘要】目的：探讨miRNAs及血清神经元PAS结构域蛋白4(NPASDP-4)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、S100β蛋白水平对急性脑血管病(ACVD)患者认知障碍的影响。方法：选取延安大学附属医院神经内科2016年1月-2019年1月收治的167例ACVD合并认知功能患者进行临床实验，按其认知功能障碍严重程度将其分成A、B、C组(轻度组、中度组和重度组)，各81例、51例和35例，将三组患者的各项临床指标均纳入SPSS21.0软件处理，分别比较三组miRNAs(miRNA-34、21、135)、NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白水平差异，以上指标与ACVD患者MMSE评分关系用Spearman秩和分析，以上指标与ACVD患者认知障碍严重程度的关系采用ROC曲线评估。结果：①A组miRNAs(34、21、135)低于B组、B组低于C组(P<0.05)，A组NPASDP-4低于B组、B组低于C组，NSE、S100-β蛋白水平高于B组，B组高于C组(P<0.05)；②Spearman秩和分析发现，除NPASDP-4与MMSE评分呈负相关(r=-0.442，P＜0.01)外，miRNAs-135相对表达量及NSE、S100-β蛋白水平与MMSE评分均呈正相关(r=0.412、0.472、0.453，P<0.05)，而miRNAs-34、21相对表达量与MMSE评分无相关性(P>0.05)；③ROC曲线结果表明，ACVD合并认知障碍患者miRNAs-135、NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白的AUC值分别为0.749、0.731、0.750、0.758，最佳截断值分别为0.70、2.04ml·L-1、13.78U·mL-1和0.23ug·L-1。结论：在ACVD合并认知障碍患者的认知功能判定中miRNAs-135、NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白与其认知障碍严重程度相关，而miRNAs-34、21则与其认知障碍严重程度无关。

【关键词】miRNAs；神经元PAS结构域蛋白4；神经元特异性烯醇化酶；S100β蛋白；急性脑血管病；认知障碍

[中图分类号]R743  [文献标识码]A  [文章编号]：1006-351X(2020)09-0540-05

Effects of serum levels of microRNAs and neuron PAS domain protein 4，NSE and S100ubeta on cognitive impairment in patients with acute cerebrovascular disease

Zhou Xuan，Xue Yidong，Guo Jie.

Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Yanan University，Shaanxi 716000，China

【Abstract】Objective：To investigate the effects of microRNAs and serum levels of neuron PAS domain protein 4，neuron specific enolase(NSE)and S100 beta protein on cognitive impairment in patients with acute cerebrovascular disease(ACVD).Methods：167 patients with ACVD and cognitive function admitted to Department of Neurology，Affiliated Hospital of Yanan University from January 2016 to January 2019 were selected for clinical experiment.According to the severity of cognitive dysfunction，they were divided into A，B，C groups(mild，moderate and severe groups)，81，51 and 35 cases respectively.The clinical indicators of the three groups were included in spss21.0 software processing，and miRNA of the three groups were compared S(mirna-34，21，135)，NPASDP-4，NSE，S100-βprotein levels were different.The relationship between the above indexes and MMSE score of ACVD patients was analyzed by spearman rank sum.The relationship between the above indexes and the severity of cognitive impairment of ACVD patients was evaluated by ROC curve.Results：① The relative expression of microRNAs(34，21，135)and the levels of NPASDP-4，NSE and S100-beta protein in group A，B and C were different(P<0.05).The levels of microRNAs(34，21，135)in group A were lower than those in group B and group B were lower than those in group C(P<0.05)，while the levels of NPASDP-4 in group A were lower than those in group B and group B were lower than those in group C，and the levels of NSE and S100-beta protein in group B were higher than those in groupC(P<0.05)；② Spearman rank analysis showed that except NPASDP-4 was negatively correlated with MMSE score(r=-0.442，P<0.01)，the relative expression of microRNAs-135 and the levels of NSE and S100-beta protein were positively correlated with MMSE score (r=0.412，0.472，0.453，P<0.05)，while the relative expression of microRNAs-34 and 21 was not correlated with MMSE score(P>0.05)；③ The results of ROC curve showed that the AUC values of microRNAs-135，NPASDP-4，NSE and S100-beta proteins in AVCD patients with cognitive impairment were 0.749，0.731，0.750 and 0.758，and the optimal truncation values were 0.70，2.04ml·L-1，13.78U·mL-1 and 0.23ug·L-1，respectively.Conclusion：MicroRNAs-135，NPASDP-4，NSE and S100-beta protein are related to the severity of cognitive impairment，while mirnas-34，21 are not related to the severity of cognitive impairment.

【Key words】Micro ribonucleic acid；Neuronal PAS domain protein 4；Neuron-specific enolase；S100beta protein；Acute cerebrovascular disease；Cognitive impairment

急性脑血管病(acute cerebrovascular disease，ACVD)是目前临床医学中一种常见、多发的脑血管疾病，分急性缺血性脑卒中和急性出血性脑卒中两种。该病的发生机制为血液受脑部血管突然破裂或因血管阻塞而不能正常的流入大脑而引起脑组织损伤。据统计[1-2]表明，ACVD患者社会活动、肢体功能及生活质量等在很大程度上均受认知障碍的影响，故为了更好的评估ACVD患者的认知障碍程度而寻找与其相关的各项临床指标十分必要。近年来，相关研究数据表明，人体中的微小核糖核酸(microribonucleic acid，miRNAs)中的miRNA-34、21、135等对ACVD患者的认知障碍均有有影响，可用于评估其认知功能[3]。神经元PAS结构域蛋白4(neuronal PAS domain protein4，NPASDP-4)异常可致患者认知功能损伤[4]。神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)对脑组织损伤有高敏感度。而中枢神经特异性蛋白(nervous specific protein，S100-β)作为一种常见的酸性钙结合蛋白同样也是反映早期脑损伤的重要标志物之一。借此本文将对延安大学附属医院神经内科收治的167例ACVD患者进行临床研究，探讨miRNAs、NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白等对其认知功能的影响，报道如下所述。

资料与方法

1、一般资料：

按《中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2014年版)》[5](中华医学会神经病学分会脑血管病学组)相关规定筛选本院神经内科2016年1月至2019年1月收治的167例ACVD合并认知功能患者进行实验，纳入标准：①经影像学、细胞组织学及病理学诊断；②发病前均意识清醒者；③各项临床资料完整者；④有不同程度的miRNAs(34、21、135)、NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白异常者；⑤患者与家属知晓签字；并经本院伦理委员会讨论通过。排除指标：①不符合以上纳入标准者；②既往心、肝、肾、胃等器质性疾病或相关功能不全者；③除认知功能障碍外，有情感、意志和行为性精神疾病者；④未签署知情同意书和临床资料不完整者。按167例ACVD合并认知功能患者的认知障碍严重程度将其分成三组，即A、B、C组，各81例、51例和35例。三组各项临床指标，如性别、年龄、受教育程度及其他疾病(高血压、糖尿病等)发生率差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。以上纳入、排除指标及相关资料均经本院医学伦理委员会批准后执行，且所有纳入者均签署知情同意书后方纳入本次实验。

2、miRNAs检测

取以上纳入者入院后的静脉血3~5mL后提取(提取方法：用天跟生化科技(北京)有限公司生产的RNA提取分离试剂盒)其全血总RNA，并将其逆转录为cDNA后扩增(仪器：实施定量PCR仪及相关试剂(美国ABI公司)，cDNA合计2uL)。扩增条件：95℃条件下分别扩增15min和15s，60℃条件下扩增1min，以上合计40个循环，接着在72℃条件下扩增延伸15min；miRNAs相对表达量均采用2-△△CT法计算，检测内容包括miRNAs-34、21、135三种。

3、血清NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白检测

所有纳入者在入院后第2天清晨抽取其空腹静脉血3~5mL后使其自然凝固，时间约0.5h左右，在常温状态下离心处理，离心速率、离心时间分别为3000r/min和10min，然后分离血清并将其置于低温冰箱(-70℃)中保存，待测。血清NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白水平均采用酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)进行检测，ELISA试剂盒购自上海通蔚实业有限公司，并严格按照其使用说明书操作与执行。

4、认知功能严重程度分级标准

认知功能内容参照郭万申等[6]研究中的简易神经状态评价量表(mini-mentalstateexamination，MMSE)评分进行评分处理，合计7个条目，即语言、视空间、时间定向力、即刻记忆、地点定向力、延时记忆、注意力及计算力等，总分合计30分，轻度认知障碍：21分<MMSE评分<26分；中度认知障碍：10分<MMSE评分<20分；重度认知障碍：2MMSE评分<10分。

5、观察指标

①性别、年龄、受教育程度、高血压、糖尿病等常规资料比较；②三组患者的miRNA(34、21、135)及神经元PAS结构域蛋白4(NPASDP-4)、NSE、S100-β水平比较；③miRNAs、NPASDP-4、NSE、S100-β与ACVD合并认知功能患者均采用MMSE评分的相关性；④以上四项指标与AVCD并认知功能障碍患者的严重程度的评估价值及ROC曲线关系。

6、统计学方法

建立Excel数据库，将167例AVCD并认知障碍患者的各项(性别、年龄、miRNAs、NPASDP-4、NSE、S100-β)临床指标基线资料、研究数据进行分类、编号及统计后纳入SPSS21.0软件处理。计数资料采用x2检验。其中计量资料采用t检验，并以(x±s)表示。而miRNAs、NPASDP-4、NSE、S100-β等指标与认知障碍严重程度的相关性采用Spearman秩和分析，认知障碍严重程度评估价值则通过绘制ROC曲线进行评定，以(P<0.05)为差异有统计学意义。

结果

1、三组常规资料比较(表1)

2、三组患者miRNAs、NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白水平比较(表2)

3、相关性分析

经Spearman秩和分析发现，除NPASDP-4与MMSE评分呈负相关(r=-0.442，P<0.01)外，miRNAs-135相对表达量及NSE、S100-β蛋白水平与MMSE评分均呈正相关(r=0.412、0.472、0.453，P<0.05)，而miRNAs-34、21相对表达量与MMSE评分无相关性(P>0.05)。

4、评估价值分析(表3、图)

ROC曲线结果表明，AVCD并认知障碍患者miRNAs-135、NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白的AUC值分别为0.749、0.731、0.750、0.758，最佳截断值分别为0.70、2.04ml·L-1、13.78U·mL-1和0.23ug·L-1。

讨论

通常情况下，认知障碍(cognitive disorder)的常见病因极多。任何引起大脑皮质功能和结构异常的因素均有可能引起认知功能障碍。而所谓认知功能障碍主要是指机体认识和获取知识的智能加工过程中的各种社会行为(如记忆、语言、思维、精神、情感等)出现异常而引起单一或一系列改变的病变过程。对ACVD患者而言，虽然其病死率在近些年来所有下降，但其伴有认知功能障碍者发展为痴呆的风险与非ACVD合并及相关疾病患者相比显著更高，且与正常人相比高出10倍[8]。故对其认知功能障碍的严重程度进行研究对ACVD及相关疾病的临床治疗无疑具有举足轻重的价值。

据统计，虽然目前ACVD患者的病死率有所下降，但其诱发认知障碍的概率却有所上升[9]。一般而言，基因调控的过程并不是单一的，而是多受多种信号转导途径的影响而使得机体中的生物大分子活性被激活，导致一系列的生理、心理负性反应。miRNAs是目前临床医学诊治过程中常见的一种非编码单链RNA分子，主要参与转录后基因表达调控。miRNAs既可抑制靶蛋白合成，也可诱导靶miRNA降解，且其在海马组织中的表达均极为丰富，它在神经系统不同信号通路中均扮演着重要角色，即参与基因调控，也在大脑学习与记忆功能中发挥着重要作用。或许正因如此，临床上才将其视作脑血管性疾病如ACVD及相关疾病、血管性痴呆等的早期诊断指标之一。学者研究发现[11]，认知障碍的发生、发展及转归与机体中的淀粉样蛋白前体(amyloidproteinprecursor，APP)同源物水平及APP相关，而miRNAs中的(miRNA-21、135)均可降低两者水平。其中miRNA-135在又对神经有保护作用，这与其可抑制突触核蛋白(synapticnucleoprotein)水平相关。

本研究发现，A组的miRNA(34、21、135)相对表达量高于B组、B组又高于C组，说明认知障碍越严重其miRNA(34、21、135)相对表达量则越低。文中Spearman秩和分析发现，miRNAs-135相对表达量与MMSE评分均呈正相关(r=0.412，P<0.05)，而miRNAs-34和miRNAs-21相对表达量则与MMSE评分不相关(P>0.05)，提示miRNAs相对表达量会随ACVD患者认知功能严重程度的改变而随之变化，其中其miRNA-135与认知功能严重程度的关系尤为密切。

NPASDP-4在海马组织中的表达水平相对较高。实验研究发现[12]，NPASDP-4对神经同样具有保护作用，这可能与它在神经元存活、突触发育、树突细胞骨架形成(海马组织)及突触可塑性的转录调控均有一定的调节作用有关。除此，相关文献也表明[13]，NPASDP-4在钙离子(Ca2+)内流的作用下可发挥选择性诱导而使抑制性突触形成被启动，继而调控机体中的依赖性基因而逐渐促进病态条件下的抑制性突触逐渐恢复正常水平。

本研究中，A组NPASDP-4低于B组、B组低于C组(P<0.05)，提示认知障碍越严重，NPASDP-4水平越高。同时文中的Spearman秩和分析发现，NPASDP-4与MMSE评分呈负相关(r=-0.442，P<0.01)，再次证明NPASDP-4水平与ACVD患者认知障碍严重程度呈正相关，即NPASDP-4水平越高，认知障碍越严重。NSE主要存在于神经组织和神经内分泌组织中，在脑组织中的活性极高。某多中心研究结果表明[14-15]，NSE在健康人群中的正常值在15.7~17ng·mL-1(95%CI)，而它作为神经元和神经内分泌细胞中的一种关键酶，其在脑组织损伤后的水平与健康人群相比显著升高或降低。本研究中A组NSE水平高于B组，B组高于C组(P<0.05)，同时其与MMSE评分呈正相关(r=0.472，P<0.05)，提示NSE水平的高低与ACVD患者认知障碍严重程度同样有相关性，即认知障碍越严重，NSE水平越低。S100-β由中枢神经系统内的星形胶质细胞合成，对脑组织损伤早期病情判断有较好的借鉴价值。它作为一种钙结合酸性蛋白，即影响蛇精原与胶质细胞的相互作用，也参与神经细胞炎性损伤的全过程，当然也参与一氧化碳(CO)合酶和炎性因子反应[16]。

本文中A组S100-β蛋白水平高于B组，B组高于C组，差异显著(P<0.05)，而Spearman秩和分析发现，S100-β蛋白水平与MMSE评分呈正相关(r=0.453，P<0.05)，提示S100-β蛋白水平越低，ACVD患者的认知障碍越严重。

本研究中的ROC曲线结果表明，AVCD并认知障碍患者miRNAs-135、NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白的AUC值分别为0.749、0.731、0.750、0.758，最佳截断值分别为0.70、2.04ml·L-1、13.78U·mL-1和0.23ug·L-1。再次证实，以上四项指标与ACVD患者认知障碍的严重程度有相关性，可用于认知障碍严重程度的评估。

综上所述，在ACVD合并认知障碍患者的认知功能判定中miRNAs-135、NPASDP-4、NSE、S100-β蛋白与其认知障碍严重程度相关，对ACVD合并认知障碍者的严重程度评估有较好的临床应用与推广价值，而miRNAs-34、21则与其认知障碍严重程度无关。

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(脑与神经疾病杂志2020年第28卷第9期)

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