发布时间:2020年03月26日 09:23:36 来源:振东健康网
陈武桂1,孙靖1,杨思振1,张莹1,胡旭1,李松涛1,沈伟伟2,廖通权1,周跃1,初同伟1
【摘 要】目的:探讨肺癌来源的信号素4D(semaphorin4D,Sema4D)在肺癌骨转移溶骨性骨破坏中的作用及机制。方法:采用免疫组织化学法检测肺癌骨转移灶及正常骨组织中Sema4D的表达情况。分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测4种肺癌细胞株中Sema4D蛋白及mRNA表达水平。收集4种肺癌细胞条件培养液,采用ELISA法检测其中Sema4D的分泌水平。收集Sema4D高表达(PC9细胞)及低表达(A549细胞)肺癌细胞的条件培养液,与成骨前体细胞MC3T3-E1共培养后,采用碱性磷酸酶染色法检测成骨细胞分化水平,采用茜素红染色法检测成骨细胞矿化能力,采用实时荧光定量PCR法检测成骨细胞分化基因如肝/肾/骨型碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,liver/bone/kidney,ALPL)、Oxterix和Ⅰ型胶原α1(collagentypeⅠalpha1,Col1α1)的表达水平。将Sema4DshRNA转染肺癌PC9细胞后,采用蛋白质印迹法、实时荧光定量PCR及ELISA法分别检测肺癌细胞中Sema4D表达与分泌水平的变化;收集肺癌条件培养液与成骨前体细胞共培养,再次采用碱性磷酸酶染色法、茜素红染色法和实时荧光定量PCR法检测干扰Sema4D表达后肺癌条件培养液对成骨细胞分化的影响。结果:与正常骨组织相比,Sema4D在肺癌溶骨性骨转移灶中高表达。Sema4D在不同肺癌细胞株中呈不同程度的表达与分泌,其中肺癌PC9细胞中表达与分泌水平最高,而肺癌A549细胞中表达与分泌水平最低(P<0.05)。肺癌条件培养液可明显抑制成骨前体细胞在成骨诱导剂诱导下的成骨分化,表现为碱性磷酸酶染色及茜素红染色的相对染色面积减小(P值均<0.05),成骨分化基因ALPL、Oxterix和Col1α1的mRNA表达水平均明显降低(P值均<0.05);并且Sema4D高表达细胞株PC9的条件培养液抑制成骨细胞分化的能力明显强于Sema4D低表达细胞株A549(P<0.05)。shRNA转染可显著降低肺癌细胞中Sema4D的表达与分泌水平(P值均<0.05),并且使肺癌细胞条件培养液对成骨细胞分化的抑制作用明显减弱(P值均<0.05)。结论:肺癌来源的Sema4D通过抑制成骨细胞分化在肺癌溶骨性骨破坏中发挥重要作用,提示其有望成为治疗肺癌骨转移的一个重要靶点。
【关键词】肺肿瘤;肿瘤转移,骨;信号素4D;成骨细胞;细胞分化
[中图分类号]R734.2[文献标志码]A[文章编号]1000-7431(2019)09-0701-11
Lung cancer cell-derived Sema4D mediates osteolytic bone destruction in lung
cancer by inhibiting osteoblast differentiation
CHEN Wuguiv,SUN Jing1,YANG Sizhen1,ZHANG Ying1,HU Xu 1,LI Songtao1,
SHEN Weiwei2,LIAO Tongquan1,ZHOU Yue1,CHU Tongwei1
【Abstract】 Objective:To determine the role of semaphorin 4D(Sema4D)in osteolytic bone destruction of bone metastasis in lung cancer,and to explore its mechanism.Methods:Immunohistochemistry was used to detect the expression of Sema4D in bone metastases of lung cancer and normal bone tissues.The expression levels of Sema4D protein and mRNA in four kinds of lung cancer cell lines were detected by Western blotting and realtime fluorescent quantitative PCR,respectively.The conditioned medium of lung cancer cells was collected,and ELISA was used to detect the secretion level of Sema4D in lung cancer conditioned medium.The conditioned medium from lung cancer cells with Sema4D high expression(PC9 cells)or low expression(A549 cells)was collected and co-cultured with osteoblastic precursor MC3T3-E1 cells,then the osteoblast differentiation ability was detected by alkaline phosphatase staining,the mineralization ability of osteoblasts was detected by alizarin red staining,the expression levels of osteoblast differentiation genes alkaline phosphatase,liver/bone/kidney(ALPL),Oxterix and collagen type Ⅰ alpha 1(Col 1α1)were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.Sema4D shRNA was transfected into lung cancer PC9 cells,then the expression and secretion levels of Sema4D in lung cancer cells were detected by Western blotting,real-time fluorescent quantitative PCR and ELISA,respectively.The conditioned medium of lung cancer PC9 cells transfected with Sema4D shRNA was collected and co-cultured with preosteoblasts,and the effect of the conditioned medium from lung cancer cells with Sema4D interference on the osteoblast differentiation was determined by alkaline phosphatase staining,alizarin red staining and real-time fluorescent quantitative PCR,respectively.Results:Compared with the normal bone tissues,Sema4D was highly expressed in osteolytic bone metastases of lung cancer.Sema4D was expressed and secreted in different lung cancer cell lines in different degrees.The expression and secretion levels of Sema4D were the highest in lung cancer PC9 cells,but lowest in lung cancer A549 cells(P<0.05).The conditioned medium of lung cancer cells significantly inhibited the osteogenic differentiation of osteoblasts induced by osteogenic inducer,which was characterized by the reduction of relative staining area of alkaline phosphatase staining and alizarin red staining((both P<0.05),and the decreased expression levels of osteogenic differentiation genes ALPL,Oxterix and Col 1α1((all P<0.05).The conditioned medium of PC9 cells with Sema4D high expression exhibited more aggressive inhibitory effect on osteoblast differentiation than the conditioned medium of A549 cells with Sema4D low expression(P<0.05).shRNA transfection significantly reduced the expression and secretion of Sema4D in lung cancer cells(both P<0.05),and significantly attenuated the inhibitory effect of lung cancer conditioned medium on osteoblast differentiation (all P<0.05).Conclusion:Lung cancer-derived Sema4D plays an important role in osteolytic bone destruction by inhibiting osteoblast differentiation,suggesting that it is expected to become a new therapeutic target for bone metastasis of lung cancer.
【Key words】 Lung neoplasms;Neoplasm metastasis,bone;Semaphorin 4D;Osteoblasts;Cell differentiation
肺癌是在中国发生率及死亡率最高的恶性肿瘤之一,其最常见的转移部位是骨骼[1]。溶骨性骨破坏作为肺癌骨转移的一个重要病理特征,是引起骨痛、病理性骨折、高钙血症和神经压迫等骨相关事件的病理基础[2]。肺癌溶骨性骨破坏的主要机制是,肺癌骨转移后产生多种肿瘤因子,破坏了成骨细胞介导的成骨和破骨细胞介导的溶骨组成的骨重塑平衡状态[3]。破骨细胞是目前已知唯一具有溶骨功能的细胞,因此以破骨细胞为靶点的抗肿瘤骨破坏研究正在广泛开展。例如,唑来膦酸和狄诺塞麦等已经被广泛应用于骨转移瘤的临床治疗,并取得了较好的临床效果,但是长期应用后发现其存在较多的局限性,并产生比较严重的不良反应[4]。近年来,越来越多的研究证实,成骨细胞在肿瘤骨转移环境中同样发挥着不可替代的作用。
本课题组前期研究证实,肺癌来源的条件培养液可明显抑制成骨前体细胞MC3T3-E1的分化,但可以促进其增殖,具体机制尚不明确[5]。目前可明确的是,肺癌相关的旁分泌分子在肺癌抑制成骨细胞分化过程中发挥重要作用。已知肿瘤相关因子如白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、单核细胞趋化蛋白1(macrophagechemotaxisandactivatingfactor-1,MCP-1)、骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和信号素3A(semaphorin3A,Sema3A)等均可促进成骨细胞分化[6-8],而极少数因子如Dickkopf相关蛋白1(Dickkopf-relatedprotein1,DKK-1)和肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等被证实可抑制成骨细胞分化[9-10]。进一步明确肺癌细胞对成骨细胞分化的抑制机制可为肿瘤骨转移溶骨性骨破坏的防治提供新的靶点。本研究即探讨信号素4D(semaphorin4D,Sema4D)在肺癌骨转移灶中的表达情况,以及其在肺癌细胞抑制成骨细胞分化过程中发挥的作用,以期为寻找肺癌溶骨性骨破坏的治疗靶点提供理论依据。
1 材料与方法
1.1细胞与主要试剂
人肺癌A549、NCI-H1975和NCI-H1299细胞株,以及小鼠颅顶前骨细胞亚克隆MC3T3-E1细胞株(成骨前体细胞)均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海);人肺癌PC9细胞由陆军军医大学第二附属医院肿瘤科惠赠;高糖DMEM培养液、RPMI1640培养液、α-MEM培养液和胎牛血清(fetalbloodserum,FBS)均购自美国Gibco公司;RNAisoPlus、PrimeScript®反转录试剂盒和SYBR®PremixEXTaqTMⅡ试剂盒购自日本TaKaRa公司;小鼠抗人Sema4D单克隆抗体购自美国BD公司;小鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自美国CST公司;青霉素-链霉素溶液、谷氨酰胺溶液、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒均购自中国碧云天生物技术研究所;PVDF膜购自美国Millipore公司;Sema4D、肝/肾/骨型碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,liver/bone/kidney,ALPL)、Oxterix和Ⅰ型胶原α1(collagentypeⅠalpha1,Col1α1)基因的PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;Sema4DELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司;β-甘油磷酸盐、L-抗坏血酸和茜素红粉末购自美国Sigma公司。
1.2免疫组织化学法检测Sema4D在肺癌骨转移及正常骨组织中的表达
收集陆军军医大学第二附属医院于2014年1月-2018年9月收治的经病理诊断证实为肺腺癌骨转移患者的临床组织标本43例,同时选取来源于脊柱骨折患者的正常成人骨组织标本10例作为对照。应用链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧物酶复合物技术对肿瘤组织中Sema4D蛋白进行免疫组织化学染色。简要步骤如下:石蜡切片经常规脱蜡、水化和抗原修复后,使用山羊血清封闭液于室温封闭30min,加入小鼠抗人Sema4D单克隆抗体(工作液体积稀释比例为1:100),湿盒中4℃下孵育过夜;次日去除一抗,经PBS漂洗后加入生物素标记的山羊抗小鼠IgG,室温孵育15min;加入适量DAB显色液,显色5min;用苏木精染色液进行对比染色后,脱水,透明,并用中性树胶封固。光学显微镜下观察染色情况,由两位病理科医师独自判断并完成记录。根据染色强度,将Sema4D蛋白的免疫组织化学染色结果分为阴性(-/+)及阳性(++/+++)表达,具体参照文献[11-12]。
1.3细胞培养与肺癌条件培养液收集
肺癌A549和PC9细胞用含10%FBS、100U/mL青霉素-链霉素混合液的高糖DMEM完全培养液进行培养。肺癌NCI-H1975和NCI-H1299细胞用含10%FBS、100U/mL青霉素-链霉素混合液的RPMI1640完全培养液进行培养。成骨前体细胞MC3T3-E1用含10%FBS、100U/mL青霉素-链霉素混合液的α-MEM完全培养液进行培养。所有细胞均置于37℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养,定期换液传代。肺癌条件培养液的收集方法如参考文献[5]所述:收集5×106个肺癌细胞,均匀接种于75cm2培养瓶中,贴壁培养24h后,更换为含1%FBS的α-MEM培养液,继续培养48h,收集上清液,离心并过滤后,置于-20℃冰箱中保存备用。
1.4成骨诱导分化及其检测
将小鼠颅顶前骨细胞亚克隆MC3T3-E1细胞均匀接种于12孔板,待细胞融合度达80%时,加入800μL含10mmol/Lβ-甘油磷酸盐和50μg/mLL-抗坏血酸的成骨诱导培养液,以及200μL无血清α-MEM培养液或肺癌条件培养液,2d换液1次。实验分3组:(1)未添加成骨诱导培养液的成骨前体细胞为阴性对照组;(2)添加800μL成骨诱导培养液及200μL无血清α-MEM培养液的成骨前体细胞为阳性对照组;(3)添加800μL成骨诱导培养液及200μL肺癌细胞条件培养液的成骨前体细胞为实验组。共培养2d后,提取成骨细胞总RNA,检测成骨相关基因ALPL、Oxterix和Col1α1的表达情况;共培养3d后,行碱性磷酸酶染色,检测碱性磷酸酶活性;共培养14d后行茜素红染色,检测成骨矿化能力。
1.5实时荧光定量PCR检测Sema4D在肺癌细胞中的表达情况以及成骨细胞分化相关基因ALPL、Oxterix和Col1α1的表达变化
根据RNAisoPlus试剂盒说明书从4种肺癌细胞(PC9、A549、H1975和H1299)以及肺癌条件培养液诱导的成骨细胞(阴性对照组、阳性对照组、肺癌A549条件培养液组和肺癌PC9条件培养液组)中分离总RNA,以PrimeScript®反转录试剂盒进行反转录,反应条件为37℃15min、85℃5s,4℃保存cDNA。使用SYBR®PremixEXTaq™和AppliedBiosystems7500快速定量实时PCR系统,通过实时PCR分析ALPL、Oxterix和Col1α1基因表达。实时荧光定量PCR的反应条件:95℃预变性30s;95℃5s,60℃退火30s,40个循环。每个样本均设3个重复孔。以人GAPDH及小鼠β-actin作内参基因,各引物序列见表1。以2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达水平。
1.6蛋白质印迹法检测Sema4D表达水平
参照文献[13],采用蛋白质印迹法检测肺癌细胞中Sema4D表达水平。简要流程如下:以RIPA裂解液收集细胞总蛋白,以BCA法检测蛋白浓度。取50μg总蛋白,以10%SDS-PAGE(70V30min,90V50min)进行蛋白分离,将分离后的蛋白条带以100V转印90min至PVDF膜;5%脱脂奶粉封闭液封闭1h,加入小鼠抗人Sema4D单克隆抗体(工作液体积稀释比例为1:1000)和小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(工作液体积稀释比例为1:5000),4℃孵育过夜,TBST漂洗10min×3次;加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(工作液体积稀释比例为1:5000),室温孵育2h,TBST漂洗10min×3次;化学发光法显色后,以凝胶成像仪显像。使用ImageJ图像分析软件分析各条带灰度值,以目的蛋白与内参GAPDH的条带灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达量。
1.7shRNA慢病毒感染及其检测
Sema4DshRNA重组慢病毒及阴性对照空病毒购自上海吉玛制药技术有限公司,序列参照文献[13]。取对数生长期的肺癌PC9细胞,按5×104个/孔的密度接种于12孔板,培养24h细胞贴壁后分为3组:未经病毒感染的PC9细胞组、感染空病毒的PC9细胞组和感染Sema4DshRNA的PC9细胞组。各组细胞中分别添加对应的慢病毒溶液(感染复数均为20)及终质量浓度为5μg/mL的Polybrene,培养24h后换液,继续培养72h后加入2μg/mL嘌呤霉素以筛选稳定转染细胞。后续待细胞生长至融合度约80%时,常规传代培养。然后分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测Sema4DshRNA慢病毒感染对肺癌PC9细胞中Sema4DmRNA和蛋白表达的影响,方法同1.5和1.6节;进一步采用实时荧光定量PCR法检测Sema4DshRNA干扰肺癌PC9细胞中的Sema4D表达后肺癌细胞条件培养液对成骨细胞分化基因ALPL、Oxterix和Col1α1表达的影响,分为阳性对照组(添加成骨诱导培养液和无血清α-MEM培养液)、肺癌PC9细胞条件培养液组(添加成骨诱导培养液和PC9细胞条件培养液)和干扰Sema4D表达的肺癌PC9细胞条件培养液组(添加成骨诱导培养液和Sema4DshRNA慢病毒感染后的PC9细胞条件培养液),方法同1.5节。
1.8ELISA法检测肺癌条件培养液中Sema4D含量
将肺癌细胞(2×104个/孔)接种在24孔板中,培养24h待细胞贴壁后,用PBS冲洗,并向每孔中加入1mL无血清DMEM培养液,4h后收集条件培养液。使用ELISA检测试剂盒检测肺癌条件培养液中Sema4D的分泌水平,简要步骤如下:设置空白对照孔、标准品孔及样本孔,样品孔中分别加入40μL样品稀释液及10μL待测样品,再加入100μL酶标试剂;用封板膜封板后,在37℃条件下温育60min;甩干液体后,加入足量的洗涤液,静置30s后弃去洗涤液,重复操作5次,拍干;每孔加入50μL显色剂A和50μL显色剂B,轻轻摇晃混匀后37℃条件下避光显色15min;添加50μL终止液,在450nm波长下测量各孔的吸光度。基于标准曲线,测定肺癌条件培养液中的Sema4D质量浓度(pg/mL)。
1.9碱性磷酸酶染色法检测成骨细胞分化能力
根据1.4节方法诱导3d后,采用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒行碱性磷酸酶染色。简要步骤如下:弃去培养液,PBS漂洗3次;4%多聚甲醛溶液固定15min,PBS漂洗3次;添加足量BCIP/NBT染色工作液,37℃避光孵育30~60min至色差明显;吸去工作液,超纯水漂洗2次,晾干后在倒置显微镜下观察并拍照。随机选取3个视野图片(放大100倍),用ImageJ图像分析软件分析染色面积所占百分比,以相对染色面积反映染色强度。
1.10茜素红染色法检测成骨矿化能力
根据1.4节方法诱导14d后,采用1%茜素红染色液(pH4.2)行茜素红染色。简要如下:弃去培养液,PBS漂洗3次;4%多聚甲醛溶液固定15min,PBS漂洗3次;添加足量的1%茜素红染色液,染色5~10min至色差明显;吸去工作液,超纯水漂洗3次,晾干后在倒置显微镜下观察并拍照。随机选取3个视野图片(放大100倍),用ImageJ图像分析软件分析染色面积所占百分比,以相对染色面积反映染色强度。
1.11统计学方法
采用SPSS18.0软件对实验数据进行统计分析。所有实验均至少重复3次,计量资料以x±s表示。率的比较采用x2检验;多组间数据的比较采用方差分析,组内两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1Sema4D在肺癌溶骨性骨转移灶中高表达
通过对43例溶骨性肺腺癌患者的骨转移标本以及10例脊柱骨折患者的正常骨组织进行免疫组织化学染色以检测Sema4D的表达。如图1所示,HE染色结果显示,肺癌骨转移表现为溶骨性骨缺损,并且充满异型肺癌细胞。免疫组织化学染色显示,Sema4D高表达于骨转移灶中的肺癌细胞,在溶骨性区域表达明显;而在正常骨组织中,骨结构完整,骨折后表现为弥漫性充血及大量炎性细胞浸润,在部分单核细胞中可见Sema4D低表达。统计结果显示,Sema4D在81.40%(35/43)的肺腺癌骨转移标本中表达为阳性,而在正常骨组织中表达阳性率为30.00%(3/10),二者差异具有统计学意义(x2=8.18,P=0.004)。
2.2nSema4D在肺癌细胞株中的表达与分泌情况
蛋白质印迹法检测结果(图2A)显示,Sema4D在肺癌PC9、A549、H1975和H1299细胞株中的蛋白相对表达水平分别为0.96±0.10、0.49±0.15、0.61±0.07和0.80±0.12,差异有统计学意义(F=10.423,P=0.004);其中,在PC9细胞株中Sema4D蛋白表达水平最高,而在A549细胞中表达水平最低,二者差异有统计学意义(t=5.19,P=0.001)。
实时荧光定量PCR结果(图2B)显示,以A549细胞为参照,Sema4D在肺癌PC9、H1975和H1299细胞株中的mRNA相对表达水平分别为4.51±0.12、1.77±0.91和2.74±0.23,差异有统计学意义(F=356.07,P<0.001);其中,在A549细胞中Sema4DmRNA表达水平最低,而在PC9细胞中表达水平最高,二者差异具有统计学意义(t=30.91,P<0.001)。
ELISA法检测结果(图2C)显示,Sema4D在肺癌A549、PC9、H1975和H1299细胞条件培养液中的分泌水平分别为(276.67±78.00)、(2139.00±267.82)、(648.33±106.70)和(972.00±233.35)pg/mL,差异有统计学意义(F=51.10,P<0.001);其中,Sema4D在PC9细胞条件培养液中分泌水平最高,而在A549细胞条件培养液中分泌水平最低,二者差异具有统计学意义(t=11.62,P<0.001)。
2.3Sema4D高表达的肺癌细胞明显抑制成骨细胞分化
分别收集Sema4D高表达与低表达的肺癌PC9和A549细胞的条件培养液,与成骨前体细胞MC3T3-E1共培养后,检测成骨细胞的分化水平。碱性磷酸酶染色结果(图3A)显示,阳性对照组中碱性磷酸酶染色的相对染色面积为(66.44±4.87)%,较阴性对照组的相对染色面积[(6.10±3.11)%]明显增加(t=17.56,P<0.001);而添加肺癌PC9和A549细胞条件培养液共培养后,碱性磷酸酶染色的相对染色面积分别为(47.19±3.11)%和(32.77±5.28)%,较阳性对照组明显降低(t=5.62,P<0.001;t=9.81,P<0.001),并且肺癌PC9细胞条件培养液共培养组较肺癌A549细胞条件培养液共培养组的相对染色面积降低更明显(t=4.19,P=0.003),差异具有统计学意义(F=109.39,P<0.001)。
茜素红染色结果(图3A)显示,阳性对照组中茜素红染色的相对染色面积为(46.72±4.17)%,较阴性对照组的相对染色面积[(4.30±2.71)%]显著增加(t=11.78,P<0.001);而添加肺癌PC9和A549细胞条件培养液共培养后,成骨细胞茜素红染色的相对染色面积分别为(33.87±6.42)%和(20.70±3.43)%,较阳性对照组明显降低(t=4.57,P=0.007;t=7.22,P<0.001),并且肺癌PC9细胞条件培养液共培养组较肺癌A549细胞条件培养液共培养组的降低程度更明显(t=3.65,P=0.006),差异具有统计学意义(F=50.87,P<0.001)。实时荧光定量PCR检测结果(图3B)显示,各组细胞中成骨分化基因ALPL、Oxterix和Col1α1的mRNA表达差异均具有统计学意义(F值分别为17.03、53.65和19.30,P值均≤0.001)。与阴性对照组相比,阳性对照组中成骨分化基因ALPL、Oxterix和Col1α1的mRNA表达均明显增强(t值分别为6.57、10.46和6.13,P值均≤0.001);而添加肺癌A549细胞条件培养液共培养后成骨分化基因ALPL、Oxterix和Col1α1的mRNA表达水平较阳性对照组均明显降低(t值分别为3.06、8.38和3.70,P值均<0.05),添加肺癌PC9细胞条件培养液共培养后ALPL、Oxterix和Col1α1的mRNA表达水平较阳性对照组也均明显降低(t值分别为5.49、11.3和6.9,P值均≤0.001)。Sema4D高表达的肺癌PC9细胞的条件培养液对成骨分化基因ALPL、Oxterix和Col1α1表达的抑制效果强于Sema4D低表达的肺癌A549细胞的条件培养液组(t值分别为2.44、2.95和3.19,P值分别为0.041、0.018和0.013)。2.4Sema4DshRNA干扰肺癌细胞中Sema4D的表达与分泌转染Sema4DshRNA至Sema4D高表达的肺癌PC9细胞中,分别以蛋白质印迹法及实时荧光定量PCR法检测Sema4D的蛋白及mRNA表达。蛋白质印迹法检测结果(图4A)显示,未经病毒感染的PC9细胞组、感染空病毒和Sema4DshRNA重组慢病毒的PC9细胞组Sema4D蛋白相对表达水平分别为0.72±0.13、0.74±0.17和0.36±0.83,Sema4DshRNA转染明显降低肺癌细胞中Sema4D蛋白表达水平(F=8.02,P=0.020;t值分别为3.34和3.58,P值分别为0.016和0.012)。实时荧光定量PCR结果(图4B)显示,感染Sema4DshRNA重组慢病毒的PC9细胞组Sema4DmRNA表达水平为0.29±0.08,明显低于未经病毒感染和感染空病毒的PC9细胞组,差异有统计学意义(F=52.74,P<0.001;t值分别为9.12和8.65,P值均<0.001)。ELISA检测结果(图4C)显示,Sema4DshRNA干扰肺癌PC9细胞中的Sema4D表达后,Sema4D在肺癌PC9细胞条件培养液中的分泌水平为(754.33±309.45)pg/mL,较未经病毒感染和感染空病毒的PC9细胞组[(1964.33±243.10)和(1840.00±190.40)pg/mL]显著降低,差异具有统计学意义(F=20.87,P=0.002;t值分别为5.87和5.27,P值分别为0.001和0.002)。
2.5干扰Sema4D表达与分泌可减弱肺癌条件培养液对成骨细胞分化的抑制能力收集干扰Sema4D表达后的肺癌PC9细胞条件培养液,与成骨前体细胞共培养后,碱性磷酸酶染色结果(图5A)显示,阳性对照组、肺癌PC9细胞条件培养液组和Sema4DshRNA干扰的肺癌PC9细胞条件培养液组相对染色面积分别为(58.49±4.81)%、(29.72±5.99)%和(44.05±6.22)%,表明PC9细胞条件培养液共培养后成骨细胞中碱性磷酸酶的相对染色面积明显减少(t=6.17,P=0.001),而干扰Sema4D表达的PC9细胞条件培养液共培养后成骨细胞中碱性磷酸酶的相对染色面积较未干扰对照组明显增加(t=3.08,P=0.022),差异具有统计学意义(F=19.06,P=0.003)。茜素红染色结果(图5A)显示,阳性对照组、肺癌PC9细胞条件培养液组和Sema4DshRNA干扰的肺癌PC9细胞条件培养液组的相对染色面积分别为(40.97±5.14)%、(16.75±3.24)%和(34.01±4.99)%,PC9细胞条件培养液共培养后成骨细胞中茜素红的相对染色面积明显减少(t=6.53,P=0.001),而干扰Sema4D表达的PC9细胞条件培养液共培养后成骨细胞中茜素红相对染色面积较未干扰对照组明显增加(t=4.66,P=0.003),差异具有统计学意义(F=22.64,P=0.002)。
实时荧光定量PCR结果(图5B)显示,各组细胞中成骨分化基因ALPL、Oxterix和Col1α1的mRNA表达差异均具有统计学意义(F值分别为39.79、39.34和131.20,P值均<0.001)。与阳性对照组相比,肺癌PC9细胞条件培养液组中成骨分化基因ALPL、Oxterix和Col1α1的mRNA表达水平均明显降低(t值分别为8.49、8.87和14.89,P值均<0.001),而干扰Sema4D表达后PC9细胞条件培养液组中成骨分化基因ALPL、Oxterix和Col1α1的mRNA表达水平较未干扰对照组均明显升高(t值分别为6.62、4.51和12.97,P值均≤0.001)。
3 讨论
肺癌骨转移后与骨基质细胞(如成骨细胞、破骨细胞和骨细胞等)之间相互调控,并打破正常的骨重塑平衡,最终介导骨破坏,这是肿瘤骨转移溶骨性骨破坏的核心机制[3,7]。破骨细胞的过度分化以及成骨细胞成骨能力的抑制是骨重塑失衡的重要机制。目前,针对骨转移中破骨细胞过度活化的机制研究已在广泛开展,因此其临床治疗方案主要是通过调控破骨细胞的过度活化或者肿瘤生长来达到控制肿瘤的目的,但尚未能获得满意疗效。而针对肿瘤骨转移中成骨细胞成骨能力的抑制机制的相关研究较少,尚无以成骨细胞为靶向的药物或者治疗方案,因此这可能是未来防治肿瘤骨转移的一个重要突破方向。
Sema4D属于Semaphorin家族,最初发现它是神经引导分子,随后研究证实其在免疫调控、肿瘤发生和血管生成等方面均发挥重要作用[14-15]。近期研究证实,Sema4D在包括肺癌在内的多种肿瘤的增殖、血管生成和转移等过程中发挥重要作用[11,15-16]。本课题组前期研究证实,干扰乳腺癌细胞中Sema4D表达可显著抑制细胞增殖及迁移[13],并且乳腺癌和头颈鳞癌等肿瘤来源的Sema4D在肿瘤溶骨性骨破坏中发挥重要作用[17-18]。本研究证实,Sema4D在肺癌溶骨性骨转移灶中高表达,而在正常骨组织中表达较少,仅在部分单核细胞中有表达,这可能与骨折后的应激性破骨细胞活化相关。既往研究证实,在破骨细胞及肿瘤相关巨噬细胞中均可表达Sema4D[19-20];然而本研究观察到Sema4D主要表达于肺癌骨转移灶中的肺癌组织,但在骨转移灶的部分成熟破骨细胞中亦存在明显表达,因此Sema4D在肿瘤骨转移灶中的来源及作用还需进一步研究证实。
Sema4D是一种相对分子质量约1.5×105的Ⅰ型膜糖蛋白,其细胞外结构域(相对分子质量约1.2×105)可作为可溶性片段,从癌细胞、内皮细胞和血小板表面脱落,从而发挥其生物活性[21-22]。本研究证实,Sema4D在多种肺癌细胞株中高表达,并且在其条件培养液中存在不同程度的分泌,Sema4D的表达与分泌水平与肺癌抑制成骨细胞分化的能力呈正相关,而干扰Sema4D表达可明显减弱肺癌条件培养液对成骨细胞分化的抑制作用,表明Sema4D是肺癌抑制成骨细胞分化的重要因子。既往研究证实,破骨细胞成熟分化过程中可分泌Sema4D,通过结合成骨细胞表面的PlexinB1受体激活下游的RhoA,并通过抑制胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1)信号转导和通过调节成骨细胞运动等抑制骨形成[20],也可通过调控成骨细胞分泌如IL-8等促进破骨细胞分化[18],因此Sema4D的具体调控网络与机制还需要进一步研究探讨。研究还发现,在绝经后骨质疏松症动物模型中,使用siRNA或中和抗体干扰Sema4D可成功地促进骨形成,而不影响骨吸收,从而成功抑制骨丢失,表明Sema4D有望成为抗骨破坏的重要靶标[23-24]。通过shRNA干扰乳腺癌细胞中的Sema4D表达可明显抑制小鼠胫骨成瘤模型中的肿瘤生长及溶骨破坏[18],表明以Sema4D为靶点的基因治疗可能具有抗肿瘤及抗骨破坏的双重疗效,Sema4D是抗肿瘤骨转移治疗的潜在靶点,但需要进一步的实验及临床研究。
综上所述,本研究证实Sema4D在人肺癌溶骨性骨转移灶中高表达,并在多种肺癌细胞株中表达与分泌水平均较高,而且Sema4D在肺癌抑制成骨细胞分化过程中发挥重要作用,有望成为肺癌骨转移溶骨性骨破坏的潜在治疗靶点。
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