胃内尿素酶阳性细菌对幽门螺杆菌感染诊断的影响

郭长城1，熊妍2，吴芳草1，潘科3，张永宏4，刘芳1，崔古贞1，朱莉2，王琼1，印琳1，陈峥宏1
（1.贵州医科大学基础医学院微生物学教研室，贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵阳市儿童医院消化内科；3．贵州省黔南布依族苗族自治州医院消化内科；4．贵州医科大学附属医院消化内科）

【摘要】目的探讨胃内可分解尿素酶菌群对基于尿素酶阳性诊断幽门螺杆菌（Helicobacter.pylori, Hp）感染的影响。方法 胃镜下取疑为Hp感染患者的胃黏膜，行快速尿素酶检测（Rapid urease test , RUT）及细菌培养，根据培养物的菌落形态、革兰染色、RUT及Hp特异性16SrRNA基因片段PCR进行Hp的鉴定；提取胃黏膜组织DNA，通过Hp特异性PCR进行Hp感染快速诊断。对Hp阴性（Hp培养或特异性PCR阴性）而RUT阳性胃黏膜培养的非Hp（non-Hp）进行常规尿素酶生化试验，选取20株尿素酶阳性non-Hp利用细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增并测序，利用NCBI 系统进行序列比对，鉴定细菌种类。 结果 606例患者胃黏膜RUT阳性率为58.4%（354/606），Hp培养阳性率29.7%（180/606）。Hp培养阴性胃黏膜特异性PCR阳性113例，Hp感染率为48.35%（293/606）。胃黏膜RUT阳性率高于胃黏膜Hp感染（χ2＝1，2.337，P＜0.05）。61例RUT阳性Hp培养或特异性PCR阴性的胃黏膜培养出80株non－Hp，其常规尿素酶生化检查均阳性。对其中20株尿素酶阳性non－Hp进行测序鉴定，均 为 产 尿 素 酶 菌。 结论 胃内存在除Hp外其他细菌，包括尿素酶阳性non－Hp，可造成RUT阳性，干扰Hp感染的实验诊断。

【关键词】 幽门螺杆菌；非幽门螺杆菌；快速尿素酶试验；胃内菌群

Effects of urease-positive bacteria flora on diagnosis of Helicobacter pylori
GUO Chang-cheng1, XIONG Yan2, WU Fang-cao1, PAN Ke3, ZHANG Yong-hong4, LIU Fang1, CUI Gu-zhen1, ZHU Li2, WANG Qiong1, YIN Lin1, CHEN Zheng-hong1

(1. Department of Microbiology, School of Basic Medical Science, Guizhou Medical University; Key Laboratory of Medical Microbiology and Parasitology, Guizhou Province Department of Education, Guiyang 550025, China; 2. Gastroenterology, Guiyang Children’s Hospital; 3. Gastroenterology, the People’s Hospital of Qiannan Autonomous Prefecture; 4.Gastroenterology, Guizhou Medical University Hospital)

【Abstract】Objective To investigate the effects of urease-positive bacteria in the stomach on the diagnosis of Helicobacter pylori infection. Methods Gastric biopsy samples were collected from patients who experienced stomach discomfort during endoscopy. Biopsy samples were submitted to a rapid urease test(RUT), bacterial isolation, and PCR amplification of H.pylori-specific 16S rDNA. H.pylori and isolates other than H.pylori were differentiated using colony morphology, Gram staining, the RUT, and PCR using primers for H.pylori-specific 16S rDNA. The urease activity of strains other than H.pylori was further identified using the RUT and a conventional urease test. Twenty urease-positive strains other than H.pylori were identified using 16S rDNA PCR and sequencing with universal primers. Result Six hundred and six gastric biopsy samples tested positive for H.pylori according to the RUT at a rate of 58.4%(354/606). H.pylori was isolated at a rate of 29.7%(180/606). One hundred and thirteen biopsy samples tested negative for H.pylori but tested positive according to H.pylori-specific PCR. The rate of H.pylori detection(testing positive for H.pylori or testing positive according to H.pylori-specific PCR) was 48.3%(293/606). The rate of H.pylori detection by the RUT was higher than the rate of H.pylori isolation(χ2=12.337, P<0.05). Sixty-one biopsy samples tested negative for H.pylori but positive according to the RUT, and 80 strains with urease activity according to the RUT and the conventional urease test were isolated from those samples. All 20 species identified with 16SrDNA sequencing were urease-positive species. Conclusion There are other bacteria besides H.pylori in the human stomach, including urease-positive strains. These bacteria may hamper the clinical diagnosis of an H.pylori infection.

【Key words】 Helicobacter pylori; non-Helicobacter pylori; rapid urease test; gastric bacteria

由于胃内酸性环境及胃蛋白酶的消化作用和胃的蠕动，长期以来人们认为胃内是一个无菌的环境[1-2]。1983年，Warren等[3]从胃病患者的胃黏膜中成功分离培养出幽门螺杆菌(Helicobacter.pylori，Hp)，打破了胃内无菌的观念。随着培养方法的改进和高通量测序技术的发展，进一步的研究表明胃内微生物达到数百种，微生物密度达102～104（CFU）/g[1，2，4]。印琳等[5]报道从胃病患者的胃黏膜中分离培养出多种非幽门螺杆菌（non-Hp），包括可以分解尿素酶的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），副流感嗜血杆菌（Hemophilus parainfluenzae）和奈瑟菌（Neisseria）等，同时发现部分胃黏膜快速尿素酶试验（Rapid urease test.RUT）阳性的患者胃黏膜Hp培养或特异性PCR均为阴性。为了分析患者胃内尿素酶阳性non-Hp对RUT检测结果及Hp感染诊断的影响，本实验对贵州医科大学附属医院、儿童医院、黔南布依族苗族自治州医院因胃部不适行胃镜检查的患者胃黏膜进行RUT检测、细菌培养及组织Hp特异性PCR检测，结果报道如下。

材料与方法

1 材料

1.1 标本 病变胃黏膜标本取自2016年8月至2017年6月因上消化道不适症状到贵州 医科大学附属医院、贵阳市儿童医院，贵州省黔南布依族苗族自治州医院就医的患者。患者术前禁食禁饮6h-8h，行无痛胃镜检查并采集胃黏膜标本。手术征得患者或监护人知情同意，实验得到贵州医科大学附属医院伦理委员会审理批准。

1.2 主要试剂及实验材料 选择性MH血琼脂培养基：100ml MH琼脂培养基（杭州滨和微生物试剂，批号150724）加入10ml无菌脱纤维羊血和400μl Hp选择性添加剂（英国OXOID 公司生产，批号：1690207，含万古霉素5.0mg，头孢磺啶2.5mg，甲氧苄氨嘧啶2.5mg，两性霉素B2.5mg）。
微需氧产气袋（日本三菱化学株式会社生产，批号：4334LJ-4）；快速尿素酶试纸（为 珠海克迪公司生产）；革兰染色液（为海博生物公司生产）；细菌基因组DNA提取试剂盒 （为上海生工公司生产，批号B909KA1110）；血液组织细胞基因组DNA提取试剂盒（为天根生化科技公司生产,批号:04201）。16SrDNA通用引物[6]（27F:5’-AGAGTTTGATCCTG-GCTC-3’；1492R为5’-ACGGCTACCTTGT-TACGACTT-3’）及Hp16SrDNA特异性引物[7]（F:5’-CTTGCTAGAGTGCTGATTA-3’;R:5’-TCCCA-
CACTCTAGAATAGT-3’）由上海英骏公司合成。

2 方法

2.1 标本处理胃黏膜标本的运送与组织匀浆按文献[5，8]的方法进行。

2.2  RUT试验 取新鲜组织匀浆液5μl，滴于RUT黄色试纸中央，然后将不干胶贴在塑料胶片上，使不干胶与塑料胶片紧密结合，1~3min观察结果。黄色试纸1min内变为红色为强阳性，3min内变为红色为弱阳性，不变色为阴性。实验严格按照产品说明书要求操作。

2.3 Hp的培养 取100? 1组织匀浆液接种到含Hp选择性添加剂的MH血琼脂培养基上于微需氧环境（10%CO2、5%O2、85%N2），37℃培养3～5ｄ。根据菌落形态、革兰染色、RUT以及Hp16SrDNA特异性片段PCR进行Hp的鉴定。

2.4 Non-Hp的培养 取100μl组织匀浆液2份，分别接种到无Hp选择性添加剂的MH血琼脂和营养琼脂培养基于10%CO2、37℃培养3～5d。观察菌落形态，并进行革兰染色镜检及RUT。

2.5 黏膜组织中Hp16SrDNA基因片段的PCR扩增 取病变黏膜组织匀浆，采用组织DNA提取试剂盒提取DNA，进行Hp特异性16SrDNA基因片段PCR扩增。PCR反应总体系26μl：包括13μl 2×Taq Master Mix，上下游引物各１μl，组织DNA模板4μl，去离子水7μl，混匀后短暂离心。PCR反应条件：94℃预处理5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延申45s，35个循环后，经72℃延伸5min。

2.6 RUT阳性 non－Hp常规尿素酶生化反应 将RUT阳性non－Hp用含酚红尿素培养 基[9]于10%CO2、37℃培养3～5d，观察培养基颜色变化。培养基由黄色变为橘红色为尿素酶试验阳性。

2.7 尿素酶阳性non－Hp菌种鉴定 分别选择10株革兰阳性和革兰阴性尿素酶阳性non－Hp，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，利用细菌16SrDNA的通用引物（27F；1492R）进行PCR，扩增PCR产物纯化后由生工生物工程上海有限公司测序，测序结果利用NCBI软件进行序列比对，鉴定菌种。

2.8 统计学分析 用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析，胃黏膜RUT阳性率与Hp感染率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1、胃黏膜标本RUT阳性率
606例患者胃黏膜RUT阳性354例，阳性率58.4%。

2、Hp和non－Hp培养及黏膜标本Hp特异性PCR结果
606例患者中有180例的胃黏膜标本培养出Hp，阳性率29.7%；369例培养出non－Hp，共573株。对Hp培养阴性胃黏膜组织进行Hp特异性16SrDNA PCR检测，阳性113例。培养阳性或PCR阳性均判为Hp感染，共293例，Hp感染率为48.38％。RUT阳性率高于Hp感染率（χ2=12.337，P<0.05）。

3、Non－Hp尿素酶试验结果
573株non－Hp，RUT阳性317株，阳性率55.32%。将61例RUT阳性Hp培养和特异性PCR均阴性的胃黏膜标本，培养出的80株RUT阳性non－Hp接种到尿素培养基于10%CO2、37℃培养3～5d，均可使培养基变为橘红色。

4、Non－Hp菌种的鉴定
20株尿素酶阳性non－Hp菌株通过测序进行菌种鉴定，其中恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）3株，唾液链球菌（Streptococcus salivarius）3株，表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）３株，腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）3株，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、产气肠杆菌（Enter-obacter aerogenes）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）、变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossi-cida）、口腔放线菌（Actionmyces oris）、粘性放线菌（Actinomyces viscosus）、内氏放线菌（Actinomyces naeslundii）、黏膜奈瑟菌（Neisseria mucosa）各1株。经查询全国临床检验操作规程[9]，均为尿素酶阳性或可变的细菌。

讨 论

Hp是多种胃病的主要致病因子之一[10-11]，也与多种胃外疾病的发生发展具有相关性[12-13]，因此Hp感染的准确诊断十分重要。目前临床上诊断Hp感染的方法可分为两大类，即侵入性和非侵入性方法。侵入性方法主要是通过胃镜取患者病变胃黏膜，利用快速尿素酶试验（RUT）、胃黏膜直接涂片染色镜检或胃黏膜组织切片染色镜检、细菌培养和基因检测 方法[14]，具有较高的准确性和特异性。判断Hp现症感染的金标准仍然是胃黏膜Hp的分离培养[15]，然而因为Hp是苛养菌，并且培养周期长，不能快速诊断，临床上难以推广[16]。非侵入性方法主要有13C尿素呼气试验（13C-UBT）、14C尿素呼气试验（14C-UBT）、血清 Hp抗体（Hp IgG）检测、粪便Hp抗原（Hp SA）检测以及唾液测试板（HSP）等[17]。血清Hp IgG检测因为抗体产生的滞后性，并且Hp清除后抗体仍然存在，所以影响Hp感染诊断的准确性[18]。Hp SA检测具有较高的敏感度、特异度和准确度[19]，但是影响因素较多，如试剂盒和技术因素[16]、粪便新鲜度、患者便秘等。目前，临床通常采用尿素呼气试验方 法诊断Hp感染，但胃内存在的其它尿素酶阳性non－Hp可能影响检测结果的准确性。

正常胃内可维持pH 1～2的酸性环境，Hp感染引起的炎症能破坏胃壁细胞的功能以及在治疗胃病时使用的质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂以及抗生素等药物的使用升高的胃内pH 值。研究表明，当pH＞3.8时，可造成微生物的过度生长[1]。目前发现胃内菌群多属于5大类：变形菌门（Proteobacteria），厚壁菌门（Firmicutes），放线菌门（Actinobacteria），梭杆菌门（Fusobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes）。健康人胃内有普氏菌属（Prevotella）、链球菌属（Streptococcus）、韦荣球菌属（Veillonella）、罗菌属（Rothia）和嗜血杆菌属（Haemophilus），这些细菌发挥维持胃稳态的作用[20-21]。当胃内生态平衡被打破后，菌群组成也会出现变化，例如胃癌（GC）患者的胃内菌群中口腔巴斯德菌（Peptostreptococcus stomatis）、咽峡链球菌（Streptococcus anginosus）、微单胞菌（Parvimonas micra），Slackia exigua和害肺小杆菌（Dialister pneumosintes）丰度明显增加[22]。
胃黏膜活检表明，non－Hp的定植可不受Hp感染的影响，这些non－Hp可能是口腔和 呼吸道的正常细菌群，更可能是胃内固有菌群，在某些情况下可以引起病理反应，如菌群失 调诱发免疫缺陷等疾病[23-25]。Khosravi等[26]报道消化道溃疡与链球菌属（Strepto-coccus）感染有关。本研究中胃病患者胃黏膜可培养细菌有假单胞菌属（Pseudomonas）、链球菌属（Strep-tococcus）、放线菌属（Actinomyces）等，与文献[27-28]报道的胃病患者胃黏膜菌群近似，多为口腔和咽部正常菌群。这些细菌是过路菌或是胃黏膜定植菌有待进一步确认。然而这些菌群中具有尿素酶活性的non－Hp可影响尿素呼气试验或RUT试验结果。并且表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、黏膜奈瑟菌（Neisseria mucosa）以及部分放线菌属（Actinomyces）具有还原硝酸盐至亚硝酸盐的活性，已经证实胃内亚硝酸盐浓度增高可促进胃病的恶性发展[29]，这类菌群在胃癌发生、发展中的作用有待进一步研究。

综上所述，胃黏膜内尿素酶阳性non－Hp的存在可影响呼气试验和RUT的结果，需要结合细菌培养、血清抗体检查及组织病理学检查诊断Hp感染。

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