2型糖尿病合并冠心病患者血清miR-21、miR-155水平与脂代谢的关系

石一夫1，张焱1，王奕1，夏芳1，梁洁1，韩荣丽1，薛红梅1，宋光明1，胡延军2
(1.上海市徐汇区大华医院上海市200237；2.上海市第六人民医院老年科)

【摘要】目的：探讨T2DM合并CHD患者血清miR-21、miR-155水平与脂代谢的关系。方法：2016年~2017年我院收治的134例T2DM患者，根据是否合并CHD，患者被分为T2DM合并CHD组(T2DM+CHD组，60例)和单纯T2DM组(74例)，检测两组血糖、血脂指标，及血清miR-21、miR-155水平，并进行比较。结果：两组患者一般资料、血压、人体质量指数(BMI)、血糖、总胆固醇(TC)水平差异均无显著性(P均>0.05)。与单纯T2DM组比较，T2DM+CHD组甘油三酯(TG)[(1.89±0.92)mmol/L比(2.75±1.61)mmol/L]、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)[(2.83±0.79)mmol/l比(3.52±1.24)mmol/L]、血清miR-21[(0.93±0.15)比(1.86±0.24)］水平显著升高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)[(1.35±0.34)mmol/L比(0.94±0.31)mmol/L]、血清miR-155[(0.95±0.19)比(0.27±0.10)］水平显著降低，P均=0.001。多因素Logistic回归分析显示，TG、LDL-C、miR-21是T2DM合并CHD发生的独立危险因素(OR=2.800~4.986，P均<0.05)，而HDL-C、miR-155则是其独立保护因素(OR=0.314，0.327，P均<0.05)。Pearson相关性分析显示，血清miR-21水平与TG、LDL-C水平呈显著正相关(r=0.415，0.506，P<0.05或<0.01)，血清miR-155水平与TG、LDL-C水平呈显著负相关(r=-0.397，-0.526，P<0.05或<0.01)。结论：在T2DM合并CHD患者，血清miR-21与TG、LDL-C水平呈显著正相关，而miR-155与TG、LDL-C水平呈显著负相关。

【关键词】糖尿病，2型；冠心病；微RNAs

[中图分类号]R541.409[文献标识码]A[文章编号]1008-0074(2019)04-419-05

Serum levels of miR-21 and miR-155 in T2DM+Chd patients and their relationship with lipid metabolism
SHI Yi-fu,ZHANG Yan,WANG Yi,XIA Fang,LIANG Jie,HAN Rong-li,XUE Hong-mei,
SONG Guang-ming,HU Yan-jun
Department of Cardiology,Dahua Hospital of Xuhui DistriCT,Shanghai,200237,China

【AbstraCT】 Objective:To explore serum levels of miR-21and miR-155in patients with T2DM complicated CHD andheir relationship with li p id metabolism.Methods:A total of 134 T2DM patients treated in our hos p ital from 2016 to 2017,were divided into T2DM+CHD group(n=60)and pure T2DM group(n=74).Blood glucose and blood lipid levels and serum miR-21and miR-155 levels were measured and were compared between two groups.Results:There were no significant difference in g eneral data,blood pressure,body mass index(BMI),glycosylated hemoglobin A1c(HbA1c),plasmag lucose and total cholesterol(TC)between two groups,P>0.05all.Com pared with pure T2DM group,there were significant rise in levels of triglyceride(TG)[(1.89±0.92)mmol/L vs.(2.75±1.61)mmol/L],LDL-C[(2.83±0.79)mmol/L vs.(3.52±1.24)mmol/L]and serum mir-21[(0.93±0.15)vs.(1.86±0.24)］,and significant reductions in levels of HDL-C[(1.35±0.34)mmol/L vs.(0.94±0.31)mmol/L]and serum miR-155[(0.95±0.19)vs.(0.27±0.10)]in T2DM+CHD group,P=0.001all.Multivariate Lo g istic re g ression anal y sis indicated that TG,HDL-C and miR-21 were inde p endent risk factors for T2DM+CHD(OR=2.800~4.986,P<0.05all),while HDL-C and mir-155 were its inde p endent p rotective factors(OR=0.314,0.327,P<0.05both).Pearson correlation analysis indicated that serum miR-21level was signficant positively correlated with TG and LDL-C levels(r=0.415,0.506,P<0.05 or<0.01),and serum mir-155 level was significant inversely correlated with TG and LDL-C levels(r=-0.397,-0.526,P<0.05 or<0.01).Conclusion:Serum miR-21 level was significant p ositively correlated with TG and LDL-C levels,but serum miR-155 level was significant inversely correlated with TG and LDL-C levels.

【Key words】 Diabetes mellitus,type 2;Coronary disease;MicroRNAs

2型糖尿病(T2DM)是临床上最为常见的一种内分泌代谢性疾病[1]。研究表明[2]，约50％T2DM患者常并发冠心病(CHD)，并发CHD可显著增加T2DM患者死亡风险。目前，有关T2DM合并CHD确切发病机制尚未完全阐明，普遍认为糖脂代谢紊乱是T2DM合并CHD最为常见的病理生理改变[3]。基于此理论，寻找与T2DM合并CHD糖脂代谢相关新型治疗靶点，对于临床治疗T2DM合并CHD具有十分重要的临床意义。微小RNA(MicrORNA，miRNA)是T2DM及CHD病理生理学途径至关重要的调节因子[4]。因此，本研究旨在探讨T2DM合并CHD患者血清miR-21、miR-155水平及其与糖脂代谢的关系，试图为临床早期诊断及治疗T2DM合并CHD提供新靶点。

1   资料与方法

1.1  一般资料

选择2016年4月~2017年4月我院收治的134例T2DM患者为研究对象，所有患者均符合中国T2DM防治指南(013年版)[5]中T2DM诊断标准，其中男性76例，女性58例，年龄44~78(52.45±6.56)岁，病程2~10(6.37±1.28)年。根据是否合并冠心病分为两组，其中T2DM合并CHD组60例，男36例，女24例，年龄45~78(3.72±5.98)岁，单纯T2DM组74例，男40例，女34例，年龄44~77(52.32±6.27)岁。纳入标准：①所有患者均符合T2DM诊断标准，合并CHD患者同时符合WHO有关缺血性心脏病诊断标准[6]，且经冠状动脉造影证实至少1支冠状动脉血管狭窄≥50％；②年龄<80岁，性别不限者；③临床资料完整者；④患者及家属了解本研究，并同意签署知情同意书者。排除标准：①有出血性脑血管意外史；②伴有炎症及免疫性疾病者；③ 伴有其他影响机体糖脂代谢疾病史，或者用药史者；④伴有肝脏、肾脏、肺脏、心脏、肿瘤等严重疾病者；⑤ 糖尿病肾病、糖尿病足等严重并发症者。本研究经本院伦理委员会批准进行。

1.2  主要试剂与仪器

同型半胱氨酸(Hcy)、高敏C反应蛋白(hsCRP)ELISA试剂盒，购自于美国Gene May公司；Trizol，购自于美国Invitrogen公司；miR-Neasy提取分离试剂盒，购自于美国Qiagen公司；琼脂糖，购自于法国Biowest公司；miRNA Reverse Transcription Kit反转录试剂盒，购自于美国ABI公司；SYBR PrimeScript RT-PCR Kit，购自于日本takara公司；PCR引物由上海生工合成。全自动生化分析仪AU5800，购自于美国Beckman公司；rT-PCR仪ABI7700，购自于美国ABI公司；紫外分光光度计，购自于美国Beckman公司。

1.3  观察指标及方法

1.3.1 常规指标检测：常规检测受试者人体质量指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)，采集清晨空腹状态下肘静脉血5ml，离心分离血清。采用AU5800全自动生化分析仪检测以下指标：(1)血糖指标：糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2hPG)。(2)血脂指标：甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)。

1.3.2 qRT-PCR检测 血清miR-21、miR-155水平：采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测血清中miR-21、miR-155表达水平。Trizol法提取受试者血清RNA，利用miR-Neasy提取分离试剂盒提取miRNA，所提miR-NAOD260/ OD280比值在1.8~2.0范围内，纯度较高，且无DNA、蛋白质残留。按照miRNA Re-verse Transcription Kit反转录试剂盒进行反转录操作，以U6为内参基因，采用qRT-PCR检测miR-21、miR-155表达水平。qRT-PCR反应体积(25μL)如下：cDNA1.0 μL，SYBR Primix Ex TaqTM 10.0 μL，Primer 1.0 μL，RNAse H2O 12.0μL。qRT-PCR引物序列见表1。qrt-PCR反应条件如下：95℃预变性5min，95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 40s，共40个循环。采用2-△CT方法处理结果，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CT u6)T2DM合并CHD组-(CT目的基因-CT U6)单纯T2DM组。

1.4  统计学分析采用统计学软件SPSS 19.1进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，比较采用t检验，计数资料以百分率表示，比较采用x2检验。采用Pearson及多元逐步回归分析进行相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  两组临床资料比较

T2DM合并CHD组与单纯T2DM组患者年龄、性别、SBP、DBP、BMI等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2  两组血糖、血脂水平比较

T2DM合并CHD组与单纯T2DM组Hba1c、FPG、2hPG、TC比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与单纯T2DM组比较，T2DM合并CHD组TG、LDL-C水平显著升高(P<0.05)，HDL-C水平显著降低(P<0.05)。见表3 。

2.3  两组血清miR-21、miR-155水平比较 与单纯T2DM组比较，T2DM合并CHD组血清miR-21水平显著升高(t=27.394，p=0.001)，miR-155水平显著降低(t=25.041，P=0.001)。见表4。

2.4  多因素回归分析

采用多因素Logistic回归分析法，以是否合并CHD为因变量(X)(是=1，否=0)，以TG(y1)、LDL-C(y2)、HDL-C(y3)、miR-21(y4)、miR-155(y5)水平为自变量进行分析，结果显示：血清miR-21的OR值为4.986，P<0.05，提示miR-21是T2DM合并CHD发生的独立危险因素之一(P<0.05)，而miR-155(OR=0.327，P<0.05)则是影响T2DM合并CHD发生的保护因素。见表5。

2.5  Pearson相关性分析Pearson相关性分析结果显示，血清miR-21水平与TG、LDL-C呈中度正相关(P<0.05)，与HDL-C水平呈中度负相关(P<0.001)；血清miR-155水平与TG、LDL-C呈中度负相关(P<0.05)，与HDL-C水平呈负相关(P<0.05)。见表6 。

3   讨论

流行病学调查显示[7]，全球范围内T2DM发病率呈现出显著上升趋势，其所致心脑血管性疾病等并发症，严重威胁了人类身体健康及生命安全。研究表明[8]，T2DM高血糖水平与全身血管性病变之间存在着密切关系，持续性高血糖可导致T2DM患者合并各种血管并发症，其中CHD是临床上T2DM最为常见并发症之一。T2DM合并CHD冠脉病变更为复杂，病变程度更为严重，且临床预后差，致残率及致死率高，给T2DM患者身体健康及生命安全造成了巨大威胁。因此，寻找早期诊断T2DM合并CHD治疗新靶点，是目前临床亟待解决的关键性问题。

微小RNA(MicrORNA，miRNA)是一类可以特异性非编码小分子RNA，其数量仅占人类基因组1%，却参与调控人类近三分之一基因的表达[9]，可通过与其靶基因mRNA 3'非翻译区相结合，从而在转录后水平调控基因的时序性表达，在生物体胚胎发育、细胞增殖、凋亡、分化等多个重要生物学方面发挥举足轻重的作用，与人类肿瘤、糖尿病、心脑血管性疾病、高血压等多种疾病发生发展密切相关[10]。许多miRNA被证实在T2DM及其并发症病理过程中发挥重要作用，呈现出治疗及检测非侵袭性疾病的潜能。miR-21是miRNA成员之一，定位于人类17号染色体q23.2上。Sekar D[11]等研究表明，miR-21与糖尿病及其相关并发症发生关系密切。国内学者阮志敏[12]等研究结果显示，外周血miR-21水平与CHD患者冠状动脉病变严重程度呈显著正相关。研究表明[13]，miR-155可靶向作用于c-Fms，抑制机体单核细胞转化为巨噬细胞，降低动脉斑块纤维帽降解，使动脉斑块趋于稳定，在CHD发生发展过程中起保护作用。目前，国内有关miR-21、miR-155在T2DM合并CHD中表达研究尚未见报道。本研究旨在探讨T2DM合并CHD患者血清miR-21、miR-155水平及其与糖脂代谢的关系，试图为临床早期诊断及治疗T2DM合并 CHD提供新靶点。

本研究所纳入两组患者年龄、性别、SBP、DBP、BMI等一般资料比较，无显著性差异，具有可比性。研究表明[14]，脂代谢紊乱与CHD发生关系密切，T2DM患者脂代谢紊乱增加可促进动脉粥样硬化及CHD发生。血脂代谢异常是动脉粥样硬化发生的重要危险因素，TG、LDL-C水平升高可促进动脉粥样硬化发生及进展，HDL-C可促进机体胆固醇代谢，HDL-C水平降低与机体发生动脉粥样硬化关系密切。本研究结果显示，与单纯T2DM组比较，T2DM合并CHD组TG、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低，提示T2DM合并CHD患者机体血脂代谢更加紊乱，与上述观点一致。与单纯T2DM组比较，T2DM 合并CHD组血清miR-21水平显著升高，miR-155水平显著降低，提示miR-21在T2DM合并CHD中呈显著高表达，miR-155呈显著低表达，二者参与T2DM合并CHD发生及发展过程。我们对血清miR-21、miR-155与TG、LDL-C、HDL-C进行相关性分析，结果显示miR-21与TG、LDL-C呈中度正相关，与HDL-C水平呈中度负相关，与TG、LDL-C呈中度负相关，与HDL-C水平呈负相关，提示机体血脂代谢越紊乱，miR-21水平越高，miR-155水平越低，推测miR-21是T2DM是并发CHD的危险因素，miR-155是减少T2DM合并CHD的保护因素，且检测二者水平有利于早期诊断T2DM是否并发CHD，预测机体血脂代谢紊乱情况。进一步的多因素logistic回归分析结果显示，miR-21是T2DM合并CHD发生的独立危险因素之一，miR-155是影响T2DM合并CHD的保护因素，与我们的推测相符，提示miR-21、miR-155参与了T2DM患者CHD的发生发展过程，具体机制可能与糖脂代谢紊乱有关。

综上所述，本研究初步揭示了T2DM合并CHD患者血清miR-21、miR-155水平及其与糖脂代谢的关系，结果表明，血清miR-21在T2DM并CHD血清中呈显著高表达，miR-155呈显著低表达，二者与患者血脂紊乱关系密切关系，不过本研究仍存在样本量较少，机制研究不深等不足之处，后续实验将进一步扩大样本量深入探究。

参考文献

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(心血管康复医学杂志2019年8月第28卷第4期)

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