microRNA-130b的表达对靶向治疗肺腺癌患者预后的影响

应朝辉，隗玉川，程万宏

【摘要】目的：探讨microRNA-130b(miR-130b)表达与经靶向治疗的肺腺癌患者预后的关系。方法：收集2013年1月至2014年1月间于大连大学附属新华医院胸外科行靶向治疗的肺腺癌患者278例，其中男113例，女165例；年龄40~82(60.8±10.3)岁。有肺癌家族史者41例，吸烟史者71例。TNMⅢ期者115例，Ⅳ期者163例。靶向治疗前4h内抽取空腹静脉血，采用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-130b的表达，并随访其生存情况。采用Kaplan-Meier并Logrank检验对经靶向治疗肺腺癌患者的生存情况进行单因素分析，采用多因素Cox回归模型分析经靶向治疗肺腺癌患者死亡的危险因素。结果：278例患者靶向治疗前miR-130b表达水平为11.3±2.1，治疗后miR-130b表达水平为9.3±1.8，差异有统计学意义(t=10.388，P<0.001)。miR-130b预测靶向治疗肺腺癌患者死亡的最佳临界点为9.93；灵敏度为82.2%，特异度为66.2%；ROC曲线下面积(AUC)为0.76。将患者分为miR-130b高表达组(miR-130b≥9.93，145例)和低表达组(miR-130b<9.93，114例)，miR-130b高表达组有肿瘤家族史、吸烟、低肿瘤分化程度以及高TNM分期患者比例高于低表达组。本组259例患者获得随访，中位随访时间为42个月，死亡191例。miR-130b高表达组、低表达组患者中位生存时间分别为36和48个月，miR-130b低表达组患者的生存情况优于高表达组(Logrankx2=28.341，P<0.001)。多因素Cox回归分析显示，肺癌家族史、吸烟史、较低分化程度、较高TNM分期miR-130b高表达是经靶向治疗肺腺癌患者死亡的独立危险因素。结论：miR-130b表达上调的肺腺癌患者靶向治疗预后更差，其可能作为肺腺癌患者靶向治疗预后的生物标志物之一。

【关键词】肺肿瘤；分子靶向治疗；预后；肺腺癌；microRNA-130b

Effect of microRNA-130b expression on the efficacy of targeted therapy for lung cancer patients

YING Zhaohui，KUI Yuchuan，CHENG Wanhong

(Department of Thoracic Surgery，the Affiliated Xinhua Hospital of Dalian University，Dalian 116021，China)

【Abstract】Objective：To investigate the relationship between the expression of microRNA-130b(miR130b)and the prognosis of targeted therapy for lung adenocarcinoma.Methods：Two hundred and seventy eight lung adenocarcinoma patients who underwent target therapy treatment in Department of Thoracic Surgery，the Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University from January 2013 to January 2014 were included.There were 113 males and 165 females among the 278 patients，age from 40 to 82 with the average age of(60.8±10.3)years old.41 patients had a family history of lung cancer，and 71 patients had a history of smoking.According to TNM stage，115 patients were classified into stage III，and 163 patients were classified into stage IV.Preoperative fasting venous blood samples were collected to measure the expression of miR-130b by quantitative realtime polymerase chain reaction(qRT-PCR)，and their survival status were followed up.Kaplan-Meier with Logrank test were used for univariate analysis，and multivariable Cox regression model were used for analysis of risk factors for targeted treatment of patients with lung adenocarcinoma.Results：The expression level of miR130b of the 278 patients were11.3±2.1 and 9.3±1.8 for before and after targeted therapy，respectively(t=10.388，P<0.001).The optimal cut-off point for miR-130b predictive death in patients with lung adenocarcinoma was 9.93 with the sensitivity of 82.2%，specificity of 66.2% and AUC of 0.76.The patients were divided into miR-130b high expression group(miR-130b≥9.93，114 cases)and low expression group(miR-130b<9.93，105 cases).The miR-130b high expression group had a higher proportion of family history of tumor，smoking，and low tumor，lower differentiation，and high TNM staging were higher than those in the low expression group.Two hundred and fifty nine patients completed followed up with a median follow-up of 42 months and191 deaths.The median survival time of patients in miR-130b high expression group and low expression group was 36 and 48 months，respectively.The survival of patients with low expression of miR-130b was better than that of high expression group(Logrank x2=28.341，P<0.001).Multivariate Cox regression analysis showed that family history of lung cancer，smoking history，lower differentiation，higher TNM stage，and high expression of miR-130b were independent risk factors for targeted treatment of patients with lung adenocarcinoma.Conclusions：The prognosis of targeted therapy for lung adenocarcinoma patients with upregulated miR-130b expression is worse，which may be one of the biomarkers for the prognosis of targeted therapy in patients with lung adenocarcinoma.

【Key words】Lung neoplasms；Molecular targeted therapy；Prognosis；Lung adenocarcinoma；microRNA-130b

肺癌是当今世界各国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈不断上升趋势，并已成为人类因癌症死亡的主要原因之一[1-2]。目前，手术仍是治疗肺癌的主要方法，但其仅适用于早期肺癌患者的治疗，而对于晚期患者则疗效不佳。近年来，分子靶向治疗因其靶向性和安全性等优点而受到越来越多的关注，并成为晚期肺癌患者的一种新的治疗方法。虽然表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)等靶向治疗药物被开发和引进，但现有的治疗方法对肺癌的治疗效果仍不理想[3-4]。微小RNA(microRNAs)可通过调节细胞生长、凋亡、转移和侵袭在肺癌发生发展中起着关键作用[5-6]。有研究显示，microRNA-130b(miR-130b)可靶向抑制胃癌细胞增殖及诱导凋亡[7]；miR-130b在黑色素瘤[8]中表达上调，而在子宫内膜癌[9]和垂体腺瘤[10]中表达下调；miR-130b可靶向调控PTEN，通过促进细胞增殖和抑制凋亡来促进儿童急性早幼粒细胞白血病的发病进程[11]。但关于miR-130b对靶向治疗肺腺癌患者预后的影响尚少见相关报道。本研究旨在探讨经靶向治疗肺腺癌患者术前血清miR130b的表达水平与预后的关系。

1、资料与方法

1.1 临床资料

选择2013年1月至2014年1月于我院胸外科接受靶向治疗的肺腺癌患者。纳入标准：①根据世界卫生组织(WHO)肺癌组织学分型和分期标准确诊为肺腺癌[12]；②未接受靶向治疗；③无其他恶性疾病(如糖尿病伴严重并发症者、严重肾脏疾病患者等)；④证实为EGFR突变阳性。排除标准：①合并胃癌、肝癌等其他恶性肿瘤；②合并抑郁症、老年痴呆等精神类疾病；③不符合靶向治疗适应证的患者。最终纳入符合上述条件的患者278例，其中男113例，女165例；年龄40~82岁，平均年龄(60.8±10.3)岁。有肺癌家族史者41例，有吸烟史者71例。根据TNM分期，Ⅲ期115例，Ⅳ期163例。按照2004年WHO分类标准，肿瘤分化程度为中高分化(G1~2)者170例，低分化(G3~4)者108例。本研究经我院医学伦理委员会批准，获患者和家属知情同意且签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 靶向治疗于治疗前7d对患者进行全面的身体检查。所有患者均行EGFR-TKIs治疗，口服250mg/d的吉非替尼(阿斯利康)或150mg/d的厄洛替尼(上海罗氏制药有限公司)，患者只要未出现死亡、无法耐受的不良反应或者明显的耐药情况，就持续使用药物维持治疗。

1.2.2 主要试剂及仪器RNA提取试剂盒TRIzol(美国Invitrogen公司)、NanoDrop2000c紫外分光光度计(美国Thermo Scientific)、逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagentKit(TaKaRa，Japan)、普通RT-PCR仪(BIO-RAD，USA)、罗氏LC480荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems，USA)。

1.2.3 采用定量实时聚合酶链反应(quantitative realtime polymerase chainrea ction，qRT-PCR)检测miR-130b的表达靶向治疗前4h内，采集患者空腹静脉血5ml，并在45min内以3000r/min的速度离心10min分离血清，置于-80℃冰箱备用。RNA的分离使用miRNeasy血清试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)。利用TRIzol(美国Invitrogen公司)提取总RNA。采用反转录试剂盒反转录获得cDNA。以U6基因为内参，应用qRT-PCR仪在ABIPRISM7500序列检测系统中进行扩增。反应条件如下：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火30s，60℃延伸1min，45个循环。引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算miR-130b的相对表达量。测量3次取平均值。

1.2.4 随访根据我院自制的随访登记表进行随访，包括患者的睡眠、饮食、用药、生存情况以及出院后的治疗情况。随访方式：上门随访、电话随访以及门诊随访等多种方式相结合。随访时间：患者出院1年内每3个月随访1次，2~4年每6个月随访1次，4~5年每年随访1次。生存时间：患者的靶向治疗时间记为该患者的生存起始时间。若死亡，则死亡时间记为终点时间；若未发生死亡，则随访结束时间记为终点时间，终点时间与起始时间的时间间隔为生存时间。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(珋x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，组内不同时点比较采用配对样本t检验；计数资料以例(%)表示，组间比较采用x2检验。绘制受试者工作特征(ROC)曲线并评价miR-130b对经靶向治疗肺腺癌患者死亡的预测价值。采用Kaplan-Meier并Logrank检验进行生存分析；将生存分析有意义的变量纳入Cox多因素回归模型，分析影响经靶向治疗患者死亡的独立危险因素。检验水准为双侧α=0.05。

2、结果

2.1 miR-130b对靶向治疗肺腺癌患者生存的预测价值

278例患者靶向治疗前miR-130b表达水平为11.3±2.1，治疗后miR-130b表达水平为9.3±1.8，差异有统计学意义(t=10.388，P<0.001)。治疗前miR-130b对靶向治疗肺腺癌患者生存的预测价值见图1，miR-130b预测靶向治疗肺腺癌患者死亡的最佳临界点为9.93。当miR-130b为9.93时，miR-130b预测靶向治疗肺腺癌患者死亡的灵敏度为82.2%，特异度为66.2%；ROC曲线下面积(AUC)为0.76。

2.2 miR-130b表达与肺癌患者临床病理特征的关系

根据ROC曲线分析结果进行分组，miR-130b≥9.93者为高表达组(n=145)，miR-130b<9.93者为低表达组(n=114)。miR-130b高表达组有肿瘤家族史、吸烟、低肿瘤分化程度以及高TNM分期患者比例高于低表达组(P<0.05)，见表2。

2.3 肺腺癌患者单因素生存分析

随访起止时间为2014年2月至2019年1月，278例肺腺癌患者中失访19例，随访率93.17%。在随访到的259例患者中，死亡191例，中位随访时间为42个月。Kaplan-Meier并Logrank检验结果显示，miR-130b低表达组患者中位生存时间为48个月，高表达患者中位生存时间为36个月，miR-130b低表达组患者的生存情况优于高表达组(Logrankx2=28.341，P<0.001)，见图2。

2.4 肺腺癌患者多因素Cox回归分析结果

以生存状态(生存=0，死亡=1)为因变量，肿瘤家族史(无=0，有=1)、吸烟史(无=0，有=1)、分化程度(高=0，中+低=1)、TNM分期(Ⅲ期=0，Ⅳ期=1)、miR-130b表达(<9.93为0，≥9.93为1)为自变量，进行多因素Cox回归分析。结果显示，肺癌家族史、吸烟史、较低分化程度、较高TNM分期、miR-130b高表达是经靶向治疗肺腺癌患者死亡的独立危险因素，见表3。

3、讨论

肺癌患者的预后较差，虽然早期肺癌患者通过常规手术治疗一般可起到根治的效果，但是手术对晚期肺癌的治疗效果较差，其5年生存率不足15%[13]。近年来，晚期肺腺癌患者分子靶向治疗虽取得了新的进展，然而由于个体异质性，不同患者的靶向治疗效果并不一致。microRNA被证明是肿瘤细胞对治疗反应的重要调节因子[14]，其表达与患者对靶向治疗的反应及肿瘤的发生发展密切相关[15-16]。

Wang等[17]研究发现，miR-130b表达上调提示肝癌患者死亡风险增大。霍续磊等[18]研究发现，miR-130b在肝硬化患者血清中的表达量显著高于健康对照者。目前关于miR-130b表达与肺癌患者预后的报道尚少见。本研究结果显示，治疗前miR-130b预测肺腺癌患者预后的AUC为0.76，灵敏度为82.2%，特异度为66.2%；另外，miR-130b低表达组患者的生存情况优于高表达组，且miR-130b高表达是经靶向治疗肺腺癌患者死亡的独立危险因素，提示miR-130b对经靶向治疗肺腺癌患者的预后判断具有一定价值。易敏等[19]研究发现，miR-130b在结肠癌组织中表达下调，并与肿瘤体积增大及高TNM分期有关。本研究结果显示，miR-130b高表达组有肿瘤家族史、吸烟、低肿瘤分化程度以及高TNM分期患者比例高于低表达组。本研究与易敏等[19]的研究结果不一致，可能是由于胚层分化来源差异造成的。miR130b对肺癌患者预后影响的机制尚不清楚。体外实验表明，miR-130b可靶向过氧化物酶体增殖物激活型受体(PPARγ)，通过血管内皮生长因子A(VEGFA)/B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)途径抑制肺癌细胞凋亡[20]。Zhang等[21]研究发现，miR-130b通过激活Wnt蛋白与β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)通路，靶向调控PTEN诱导肺癌细胞的耐药性。

综上所述，miR-130b对肺腺癌患者靶向治疗预后的判断具有一定价值，miR-130b表达上调的肺腺癌患者靶向治疗预后更差，其可能作为肺腺癌患者靶向治疗预后的生物标志物之一。

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(中国肿瘤外科杂志2020年4月第12卷第2期)

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