基于分子，内镜，组织学和循环生物标志物的嗜酸性胃炎诊断方法研究

节选翻译：振东文宣编辑部/菁菁

本文初次发表在2020年最新的美国医学学术期刊《过敏及临床免疫学杂志》，文献开发了基于活检样本和血检样本的嗜酸性胃炎检测组合，揭露了胃分子特征和组织学以及内镜特征之间的密切关系，从而为这一疾病的临床诊断和科学研究提供了参考。

【摘要】背景：嗜酸性胃炎是一种病理性胃炎，表现出明显的胃嗜酸性粒细胞增多和相关临床症状。当前诊断工具的精确度尚不能满足嗜酸性胃炎患者的需求。目的：我们旨在开发基于活组织检查和血液检查的嗜酸性胃炎综合诊断方法。方法：参与本次研究的9个嗜酸性胃肠道疾病相关的研究联盟对嗜酸性胃炎患者和非嗜酸性胃炎受试者开展了临床试验。本次研究主要分析了嗜酸性胃炎的诊断检测组合（EGDP）和血液检测组合(蛋白质多重阵列)。该疾病的诊断检测组合评分取决于18个高度失调的基因表达，而血液检测组合评分取决于细胞因子或趋化因子的失调水平。结果：本次研究分析了185名受试者的胃活检标本和血液样本（嗜酸性胃炎患者组，74名；非嗜酸性胃炎对照组，111名）。诊断检测组合（1）确定了当前患有嗜酸性胃炎的患者（P <0.0001， 曲线下面积≥0.95），（2）有效地监测了纵向样本中的疾病活动（P =0.0078），（3）在同一患者样本中具有高度相关性（r =0.85, P<0.0001），（4）且与胃峰值嗜酸性粒细胞水平（r =-0.83, P <0 .0001），胃周周围环（r=-0.73, P < 0.0001）和内窥镜结节（r=--0.45, P < 0.0001）呈负相关。血液检测组合显示， 嗜酸细胞活化趋化因子-3，胸腺和激活调节的趋化因子，IL-5和胸腺基质淋巴细胞生成素水平显著增加。血液检测的嗜酸性胃炎分数：（1）区分了嗜酸性胃炎患者组合非嗜酸性胃炎对照组（P<0.0001,曲线下区域≥0.91），（2）与嗜酸性胃炎粒细胞水平相关（血浆：r=0.72,P=0.0002；血清：r=0.54,P=0.0015），（3）与DGDP18分数负相关（血浆：r=-0.64,P=0.0015；血清：r=-0.46,P=0.0084）。血浆嗜酸细胞活化趋化因子-3水平与胃部CCL26表征密切相关（r=-0.81, P＜0.0001）。结论：本研究开发了基于活检样本和血检样本的嗜酸性胃炎检测组合，揭露了胃分子特征和组织学以及内镜特征之间的密切关系，从而为这一疾病的临床诊断和科学研究提供了参考。

【关键词】循环生物标志物，诊断检测组合，嗜酸性粒细胞，嗜酸性胃炎

1、引言

嗜酸性胃炎是一种嗜酸性胃肠道疾病，其特征是嗜酸性粒细胞在胃肠道中明显积累、增多。估计患病率约为每100,000名受试者中有6.3名，这一数字可能正在增加。以往对嗜酸性粒细胞性食道炎的研究已经阐明了其发病机制中涉及的特定分子、细胞、免疫机制。但是，嗜酸性胃炎不如嗜酸性食道炎常见，因此人们对其了解较少，几乎没有出版物涉及嗜酸性胃炎的诊断标准、遗传特性、生物标志物，以及疾病的发病机理。与食道不同，在胃粘膜中，嗜酸性粒细胞通常在体内稳态过程中驻留，这增加了疾病诊断和检测的复杂性。

本研究旨在为嗜酸性胃炎开发基于组织和血液的诊断组合。验证诊断组合在诊断，监视和管理中的效用；通过同时分析组织学和内窥镜检查结果评估其临床意义；并深入了解疾病的发病机理。为实现这一目标，我们通过嗜酸性胃肠道疾病研究者联合会获得了嗜酸性胃炎患者样本，并获得了独立的复制队列。

2、方法与结果

本次研究总共覆盖185例患者，获取了201个胃部活检样本、155个血液检查样本。总体样本中，包括了74位嗜酸性胃炎患者和111位非嗜酸性胃炎对照参与者。本次研究参与者的年龄覆盖了从1到67岁，其中124(67%)人为儿童，61（33%）人为成年人。本次研究中男性和女性参与者比例相当，共有90（48.6%）名男性和95（51.4%）名女性。在所有样本中，胃嗜酸性粒细胞峰值的计算范围为0-352个每高倍视野。未患有嗜酸性胃炎的对照对象则表现为0-28个嗜酸性粒细胞每高倍视野。未患有嗜酸性胃炎的对照组（n=111）包括患有特应性合并症（n=47 42.3%）。慢性胃炎（n=44 39.6%）和未患有嗜酸性胃炎但患有活跃性嗜酸性食道炎的患者（n=20 18.0%）。

在基于活组织检测组合（n=134）和基于血液检测组合（n=108）的分组中，基本人口统计学特征没有显著差异。在嗜酸性胃炎患者（n=74）中，食道未并发嗜酸性粒细胞增多的病例有46例（62%），结肠中并发嗜酸性粒细胞增多有2例（3%） 食道和结肠中均并发嗜酸性粒细胞增多的患者有3例（4%）。但是，基于活组织检测组合和血液检测组合，活跃性嗜酸性胃炎患者与未患有嗜酸性胃炎的对照对象在年龄、性别、种族、特应性状态等方面没有显著差异。

为了获得分子基础以建立嗜酸性胃炎诊断组合标准，本研究寻找在多个试验平台上均守恒的基因集。本研究从活跃的嗜酸性胃炎患者组（n=9）和非嗜酸性胃炎对照组（n=12）生成了胃组织的RNA测序数据集。主成分分析表明，由1226个差异表达基因定义的两个组可以可靠地区分。然后，我们将该基因标签与与最近发布的、基于微阵列的两个基因表达谱进行了重叠。在细胞因子/趋化因子相关通道中，特别是IL-13通道中，上调基因明显更加丰富。

3、讨论与结论

本研究采用胃部mRNA转录物和循环蛋白水平建立了嗜酸性胃炎的分子诊断标准。本文主要成果包括：（1）开发了一组由48个基因组成的嗜酸性胃炎转录组，可以将嗜酸性胃炎患者和非嗜酸性胃炎患者区分开来。该转录组在处于不同地点和不同年龄（包括成人和儿童）、接受不同治疗方案的患者中均表现相同。（2）确定嗜酸性胃炎诊断的评分仅基于18个基因子集的变化，并命名为EGDP18评分。这一评分能够在临床诊断中排除非嗜酸性胃炎对照者、仅限于食道的嗜酸性粒细胞增多患者，确认嗜酸性胃炎患者（发现、验证队列的敏感性为88%至95%，而特异性为100%）；（3）确定EGDP18评分可以将活动性嗜酸性胃炎患者和非活动性嗜酸性胃炎患者区分开，且判定结果与胃嗜酸性粒细胞水平密切相关（r=-20.83,P＜0.0001）。因此EGDP18评分可能有助于诊断中度嗜酸性粒细胞水平；（4）确定CCL26，CLC，IL13RA2，BMP3，IL-5，CDH26，CCL18，NPY，HPGDS和SST等特定基因的表达与组织嗜酸性粒细胞增多相关；（5）将分子表征的变化幅度与内窥镜检查结果的变化联系起来。其中，最显著的关系是结节和颗粒度与2型验证基因子集相关联，这一基因子集包括了CCL26和IL134A2；（6）将分子表征变化的幅度与组织学检查结果的变化联系起来。其中最显著的关系是，CCL26水平与腺周环（r=-0.74, P=7.0E-21） 及腺体嗜酸性粒细胞增多（r=-0.68, P=2.0E-16）密切相关。（7）识别反映胃部变化的循环生物标志物，最显著的标志物是胃嗜酸性粒细胞。（8）发现血浆嗜酸细胞活化趋化因子-3、TARC和IL-5联合检测对嗜酸性胃炎的诊断有较高的敏感性和特异性（分别为100%和72%）。

本研究分析了200多个胃组织样本并评估了分子谱之间的重叠。嗜酸性胃炎和嗜酸细胞性食道炎均具有TH2分子发病机制。尽管嗜酸性胃炎和嗜酸细胞性食道炎共同特征为IL-13诱导，但二者基于微阵列分析评估的转录组仅重叠7%。本研究采用了独立RNA测序和定量聚合酶链式反应阵列方法，证实了我们先前的观察结果，即嗜酸性胃炎和嗜酸细胞性食道炎的总体基因表达谱在转录水平上是不同的。之前的组织病理学研究表明，嗜酸性胃炎患者的嗜酸性粒细胞浸润可能是不完全的，诊断嗜酸性胃炎所需要的胃嗜酸性粒细胞最小阈值各不相同，变化范围为从1高倍视野中20嗜酸性粒细胞每高倍视野，到3高倍视野中70嗜酸性粒细胞每高倍视野。本研究仅需对每一位患者采集1个RNA样本即获得结果。这意味着，分子诊断是一种相对来说敏感度高、前景较好的诊断方法。EGDP18评分算法表明，组织学检查显示中度病症的患者中，约有63%与具有活动性嗜酸性胃炎的患者在分子检查结果中等效。这一证据表明，少于5高倍视野，39嗜酸性粒细胞每高倍视野检查结果与分子性炎症过程相关。即，少于5高倍视野的检查分析足以支持嗜酸性胃炎的诊断。

此外，为了进一步剖析疾病的发病机理，本研究评估了分子谱与组织学和内镜检查特征之间的相关性。针对嗜酸性胃炎的组织学特征，在各种分布状态下，嗜酸性特征（包括腺周环，嗜酸性腺炎，固有层嗜酸性粒细胞增多，表面上皮嗜酸性粒细胞增多等）与嗜酸性胃炎转录组（特别是EGDP的18个核心基因）高度相关。研究发现部分组织学特征与EGDP相关度不高，原因为活检标本的深度不足，从而导致组织学检查结果中未表现肌层粘膜及部分组织学特征。这些组织学特征包括固有层纤维化，表面侵蚀或溃疡，嗜酸性粒细胞脓肿，急性炎症细胞等。此外，内窥镜检查显示发生改变的某些特征（如结节、粒度），与转录物改变唯一相关。对于部分富含炎症反应的特征来说，尤为明显。这些炎症反应涉及2型免疫以及嗜酸性粒细胞相关通道IL13RA2、CCL26、IL5的上调。CCL26和IL13RA2均为IL-13诱导基因，但关于IL-13是激活信号分子还是抑制信号分子尚存在争议。

2型免疫相关反应的显著作用为抗IL-4受体，抗IL-13Ra1，以及抗IL-13的治疗干预提供了科学依据。在结节相关的其它特应性疾病患者中，2型免疫/嗜酸性粒细胞相关通道的表达水平也存在上升的现象。这意味着2型免疫/嗜酸性粒细胞相关通道表达水平的上升不是针对嗜酸性胃炎的特异反应，而是相对于结节相关病症的普遍反应。

此外，内窥镜检查结果中的症状变化，如脆性和红斑，和IL33、SLG26A7、ATP4A基因的下调有关。这些基因表达水平的下降可能是组织发炎、粘膜受损的表征。和此前已经报告的8例原发性嗜酸性胃炎患者相比，本次研究的结果显示仅有极少重叠(例如AREG,CXCL8,SST和TGFBR1)。可能由于样本大小，其中13例的分子检测组合和内窥镜检查特征出现了分歧。然而，通过对本次大样本嗜酸性胃炎患者的检测组合结果的研究，我们可以鉴定出潜在通道不同的特定发现。

当前，临床上进行嗜酸性肠胃失调诊断需要获得活检样本，该领域迫切需要可以无创获得的生物标志物。此前的研究表明，基于嗜酸性胃炎与循环性嗜酸粒细胞增多症共发，嗜酸性胃炎比嗜酸细胞性食道炎更具有系统性。

因此，我们假设嗜酸性胃炎患者可能存在循环生物标志物。研究证实了这一假设。与非嗜酸性胃炎对照组相比，嗜酸性胃炎患者组的血清和血浆中嗜酸细胞活化趋化因子-3和IL-5均显著上调。并且，嗜酸细胞活化趋化因子-3的循环水平和CCL26的组织表达显著相关。值得注意的是，嗜酸性胃炎患者血浆中的嗜酸细胞活化趋化因子-3水平通常不能反映特应性状态，因为在嗜酸细胞食道炎患者中血浆嗜酸细胞活化趋化因子-3水平并未升高。

此外，嗜酸性胃炎患者的平均循环嗜酸细胞活化趋化因子-3水平似乎明显高于其他特应性疾病患者，例如慢性鼻-鼻窦炎伴嗜酸性粒细胞计数高的粘膜浸润（血浆：122.6 vs 481.2 pg / mL）。但是血清的范围与另一种罕见的嗜酸性粒细胞肉芽肿合并多血管炎的情况相同。

我们推测，胃部（相关疾病嗜酸性胃炎）可能比食道（相关疾病嗜酸性食道炎）导致更高的嗜酸细胞活化趋化因子-3水平。这是因为胃部和食道的基本组织结构存在差异。与食道黏膜相比，胃黏膜与脉管系统的距离相对较远，胃黏膜面积也相对较大，并且在稳态过程中存在嗜酸性粒细胞。嗜酸性胃炎患者中循环嗜酸细胞活化趋化因子-3水平相对其他嗜酸性肠胃失调s升高更为显著的原因值得进一步关注。

本次研究通过采集来自不同研究中心的自体样本，发掘了同一疾病中的组织特征和循环细胞因子谱，这在嗜酸性肠胃失调研究领域是开创性的。本研究的目的不在于在临床上取代传统组织检测方法，而在于提供关于至少2个检测组合的替代性选择。这将使嗜酸性胃炎的临床诊断更精确/更敏感。

在嗜酸性肠胃失调/嗜酸性胃炎的筛查工作中，循环生物标志预期可以作为早期的非入侵性检查手段。而EGDP可以用于确定性诊断。两种诊断方法的结合可以为诊断监测工具以进一步了解嗜酸性胃炎亚型的信息。针对基于血液检测组合进行诊断治疗的嗜酸性胃炎，未来的研究应检查其缓解情况，这将有助于避免反复进行内窥镜检查。

本研究具有四项优势。首先，本研究分析了来自美国多个地点的样本，这使研究结果的空间应用范围更广，具有更好的可推广性。其次，本研究对参与者进行了多次诊断评估，从而发掘了基因表达与内镜和组织学检查参数之间的关联性。第三，本研究不仅评估了基因表达，还衡量了血液中的循环蛋白水平。第四，在独立队列中，本研究验证了不同嗜酸性胃炎的基因表达差异。

本研究也存在局限性。首先，研究发现如果患者患有难治性疾病或处在活动性嗜酸性胃炎的混合治疗状态，可能会影响研究结果。但是，患者的临床、组织学、分子学检查仍旧显示疾病迹象。其次，本研究中的大多数基因和生物标志物表达分析均基于EGDP中包括的48个基因和10种血液生物标志物。如果进一步采取无偏的全基因组转录组和蛋白质组方法可能会揭示其他相关基因和生物标志物的最佳组合。最后，受限于截面数据研究方法，本研究强调了短期数据特征，缺乏前瞻性和纵向研究。

总之，本研究开发了能够使用血液和生物样本进行嗜酸性胃炎检测组合的方式。在嗜酸性粒细胞相关的单一组织疾病和循环疾病中，CCL26/嗜酸细胞活化趋化因子-3 是表现最为显著的生物标志物。本研究总结了嗜酸性胃炎的分子概况，发现腺周环和内窥镜下的颗粒或者结节之间具有很强的关联性，为深入了解嗜酸性胃炎的发病机理提供了参考。在未来，需要进一步的工作以将这些检测组合应用于不同临床环境中的前瞻性试验，探索可行性，进行进一步验证，并优化关于疾病分层的检测组合。

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