Mac-2结合蛋白与经超声造影诊断的人颈动脉粥样硬化斑块不稳定性和临床表现的相关性分析

左鹏飞李亚峰顿国亮
(宝鸡市中心医院超声医学科陕西宝鸡721000)

【摘 要】目的：探讨Mac-2结合蛋白(M2BP)与经超声造影诊断的人颈动脉粥样硬化斑块不稳定性和临床表现的相关性。方法：回顾性选取2016年8月至2018年12月在宝鸡市中心医院行颈动脉内膜剥脱术的患者50例。所有患者均经常规二维灰阶超声、彩色多普勒血流显像及超声造影诊断，颈动脉狭窄>70%。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测M2BP在患者血浆中的含量，M2BP蛋白及mRNA的表达采用免疫组化及实时定量PCR的方法检测。采用Pearson方法分析M2BP表达与斑块中巨噬细胞、平滑肌细胞及胶原蛋白等其他成分含量的相关性。结果：M2BP在人颈动脉斑块巨噬细胞标记物CD68处高表达，而在平滑肌细胞标记物α-SMA处甚少表达。M2BP在含有坏死中心的晚期斑块Ⅱ型)和破裂斑块(Ⅲ型)中的表达比在纤维完整的斑块(Ⅰ型)中的表达高。M2BP在有临床症状患者中的表达显著高于无临床症状患者，在脑卒中及短暂性脑缺血发作患者中的表达显著高于一过性黑朦患者，在症状持续间1个月及1~3个月患者中的表达显著高于3个月患者，在无回声斑块和不均质回声斑块患者中的表达显著高于有回声斑块患者(P<0.05)。M2BP阳性表达与巨噬细胞标记物CD68及细胞凋亡呈正相关(P<0.05)，与平滑肌细胞标记物α-SMA及胶原蛋白阳性面积呈负相关(P<0.05)。结论：M2BP在人颈动脉斑块易损区和晚期斑块中高度表达，并且与临床缺血表现显著相关。

【关键词】Mac-2；结合蛋白；超声；超声造影；炎症；斑块不稳定性

Correlation between Mac-2 binding protein and the instability and clinical manifestations of human
 carotid atherosclerotic plaque diagnosed by contrast-enhanced ultrasonography.
ZUO Peng-fei,LI Ya-feng,DUN Guo-liang.Department of Ultrasound,Baoji
 Central Hospital,Baoji Shaanxi 721000,China.

【Abstract】 Objective:To investigate the correlation between Mac-2 binding protein (M2BP)and the instability and clinical manifestations of human carotid atherosclerotic plaque diagnosed by contrast-enhanced ultrasound.Methods:50 patients with carotid endarterectomy in Baoji Central Hospital from August 2016 to December 2018 were selected.All patients were diagnosed by conventional two-dimensional grayscale ultrasound,color Doppler flow imaging and contrast-enhanced ultrasound with carotid stenosis >70%.The content of M2BP in plasma was detected by EILSA method.The expressions of M2BP protein and mRNA were detected by immunohistochemistry and real-time quantitative PCR.Pearson method was used to analyze the correlation between expression of M2BP and other ingredient content including macrophages,smooth muscle cells and collagen in plaque.Results:M2BP was highly expressed at macrophage marker CD68 of human carotid plaque and was rarely expressed at the smooth muscle cell marker α-SMA.M2BP expression was higher in advanced plaques containing necrotic centers(type II)and ruptured plaques(type III)than that in intact plaques(type I).The expression of M2BP in patients with clinical symptoms were significantly higher than that in patients without clinical symptoms,and the expression in patients with stroke and TIAs were significantly higher than that in patients with AF,and the expression in patients with symptom duration of 1 month and 1-3 months were significantly higher that in patients with symptom duration of 3 months.The expression of M2BP in patients with echogenic plaques and heterogeneous echogenic plaques was significantly higher that in patients with sputum plaques and ovarian plaques(P<0.05).The positive expression of M2BP was positively correlated with macrophage infiltration and apoptosis,and negatively correlated with smooth muscle cells and collagen positive area(P<0.05 ).Conclusion:M2BP is highly expressed in the vulnerable areas of human carotid plaques and in advanced plaques,and is significantly associated with clinical ischemic manifestations

【Key ords】Mac-2 binding protein;Ultrasound;Contrast-enhanced ultrasonography;Carotid atherosclerotic plaque

脉粥样硬化主要表现为脂质在血管壁沉积以及有大量促炎细胞和细胞因子的参与其中[1]。一般认为，急性缺血(包括急性冠状动脉综合征和脑卒中)的致病机制主要是不稳定斑块急性破裂伴随的闭塞性血栓形成或远端栓塞[2]。虽然其潜在的作用机制还尚未完全清楚，但已证实炎症在动脉粥样硬化斑块发展和不稳定过程中起至关重要的作用[3，4]。Mac-2结合蛋白(M2BP)是一种分泌型糖蛋白，属于巨噬细胞清道夫受体超家族成员之一，富含半胱氨酸，存在于多种组织及体液中[5]。研究已经表明，M2BP与支气管哮喘、肝纤维化、慢性胰腺炎静脉血栓形成等炎症性疾病显著相关[6]。体外研究也显示，M2BP的促炎作用与其调节外周血单核细胞[增加白细胞介素-2(IL-2)产生)和骨髓基质细胞[增强白细胞介素-6(IL-6)产生]的能力有关[7]。此外，回顾性研究结果显示，血浆M2BP水平可独立预测经冠状动脉计算机断层扫描血管造影(CCTA)诊断的冠心病患者的长期死亡率[8]。由于M2BP的促炎特性及其与动脉粥样硬化及冠状动脉疾病的潜在关联，本研究推测M2BP可能在斑块的不稳定性中发挥重要作用，但是目前关于M2BP在动脉粥样硬化斑块中的表达还鲜少报道，因此本研究主要探讨M2BP在人颈动脉斑块中的表达及其与斑块不稳定性的潜在关联。

1  资料与方法

1.1一般资料回顾性选取2016年8月至2018年12月在宝鸡市中心医院行颈动脉内膜剥脱术的患者50例。男性38例，女性12例，平均年龄(65.3±7.2)岁。手术指征指狭窄>70%和有临床症状(n=40)，以及狭窄>70%和无临床症状(n=10)。临床症状指一过性黑矇(AF)、短暂性脑缺血发作(TIAs)和脑卒中。无临床症状指患者在6个月内没有斑块相关的神经症状。有临床症状的患者排除其他可能导致这些症状的因素，如心房颤动和血栓形成。排除标准也包括：癌症、全身性炎症疾病、感染、肾功能衰竭、急性或慢性肝病以及心源性休克。根据症状持续的时间将有临床症状患者分为3类，包括1个月、1~3个月和3个月。AF指单眼视力丧失数秒或数小时而没有其他神经系统症状的患者；TIAs指半球神经功能缺损持续时间少于24h的患者；脑卒中的定义参照文献[9]。所有患者在术前经2位神经可医生检查，患者知情同意。

1.2超声检测及超声造影采用常规二维灰阶超声、彩色多普勒血流显像及超声造影对颈动脉狭窄患者进行诊断并分类。颈动脉超声检查采用Philips公司的EPIQ7C型彩色多普勒超声诊断仪，采用L12-3线阵探头，探头频率3~12MHz。患者呈仰卧位，头略后仰偏向检查对侧，探查颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。根据超声检测的斑块回声强度将斑块分为无回声斑块、有回声斑块和不均质回声斑块。纳入标准：选择位于颈总动脉的颈动脉粥样硬化斑块，斑块厚度2mm，长度10mm。对此斑块进行超声造影检查。超声造影剂采用Bracco公司的Sono Vue，用量为2.0ml，采用团注法经肘部浅静脉注射，之后立即推注5ml0.9%氯化钠溶液。机械指数设为0.08~0.80。在注射造影剂的同时启动内置计时器，实时观察斑块内造影剂的显影变化。

1.3样本采集及血浆M2BP检测在手术前一天收集每个患者的外周血，制备血浆，储存于-80℃直至分析。采用Abcam公司的人M2BP酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒分析血浆中M2BP的含量，严格按照说明书操作。

1.4免疫组化和组织学染色取术中剥落的颈动脉斑块，一部分斑块直接用液氮速冻，另一部分斑块用生理盐水冲洗后用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，用切片机切割成5μm厚的薄片，置于载玻片上，展片、烤片。然后经二甲苯脱蜡、各级乙醇水化、热抗原修复、内源酶灭活后，在湿盒内用5%胎牛血清室温封闭30min，孵育一抗，4℃过夜。孵育二抗，室温30min。然后滴加100μl的DAB溶液。显微镜下观察染色合适时终止染色。苏木素复染、分化、脱水、封片和拍照。采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天公司)检测斑块切片中凋亡细胞的阳性面积(%)。采用Masson染色检测斑块切片中胶原蛋白的阳性面积(%)。采用ImagePro-Plus6.0软件统计分析免疫组化及染色的结果。

1.5实时定量PCR采用Trizol试剂从颈动脉斑块中提取总RNA，用Prime Script TMII 1st StrandcDNA合成试剂盒合成cDNA。采用SYBR Green PCR Mastermix进行实时定量PCR。试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。根据2-△△Ct计算相对含量，GAPDH为管家基因。引物由Primer designing tool在线软件设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：M2BP：5'-CCTGTCGTCAGTCAAGTGCT-3'(F)，5'-AT-ACAGGTCCAGGGGCATCT-3'(R)GAPDH：5'-GAAGACGGGCGGAGAGAAAC-3'(F)，5'-CCATGGT-GTCTGAGCGATGT-3'(R)。

1.6斑块分类根据斑块的形态及胶原蛋白染色的结果将所有颈动脉斑块分为3类。Ⅰ类斑块(n=10)为完整斑块，纤维帽>100μm，无脂肪池，少量白细胞浸润和完整的内弹性膜；Ⅱ类斑块(n=25)为完整斑块，有少量坏死中心、白细胞浸润以及纤维帽<100μm；Ⅲ类斑块(n=15)为破裂的斑块，含有大量坏死中心，并伴有大量白细胞浸润、新血管形成、斑块内出血或血栓形成。

1.7统计学分析所有数据均采用均数±标准差(x珋±s)表示，SPSS19.0进行数据统计分析。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，LSD多重比较，Pearson相关性分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1 颈动脉经超声和超声造影检查结果灰阶超声和彩色普勒表现(CDFI)显示在颈总动脉内膜增厚，有斑块存在，低回声，斑块内有血流信号，狭窄>70%，提示可能为溃疡斑。箭头所指为斑块。见图1。超声造影显示斑块内有点状及短线状增强(左图，箭头所指)，提示可能有新生血管形成。见图2。

2.2 M2BP在人颈动脉粥样硬化斑块中的分布在巨噬细胞标记物CD68高表达处，M2BP也呈高表达状态；在平滑肌细胞标记物α-SMA高表达处，M2BP呈低表达状态。见图3、图4。M2BP在Ⅱ型斑块和Ⅲ型斑块中的表达高于在Ⅰ型斑块中的表达。见图5。

2.3 M2BP表达与临床症状的相关性分析血浆M2BP及M2BPmRNA在有临床症状患者中的含量及表达显著高于无临床症状患者(P<0.05)；在脑卒中及TIAs患者中的含量及表达显著高于AF患者(P<0.05)；在症状持续时间<1个月及1~3个月患者中的含量及表达显著高于3个月患者(P<0.05)。此外，对斑块类型及临床症状的进一步分析显示，大部分无临床症状的患者都具有Ⅰ型斑块(9/10)。而脑卒中或TIAs患者的颈动脉斑块均具有坏死中心(Ⅱ型斑块)或纤维帽破裂(Ⅲ型斑块)这些特点。见表1。

2.4 M2BP表达与斑块回声强度的相关性分析血浆M2BP及M2BPmRNA在无回声斑块和不均质回声斑块患者中的含量及表达显著高于有回声斑块患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.5M2BP表达与斑块中其他成分的相关性分析M2BP阳性表达与巨噬细胞标记物CD68及细胞凋亡呈正相关(P<0.05)，与平滑肌细胞标记物α-SMA及胶原蛋白阳性面积呈负相关(P<0.05)。见表3。

3  讨论

心脑血管不良事件的发生主要是由动脉粥样硬化斑块不稳定，发生溃破、出血，随后血栓形成，引起不同程度的动脉管腔堵塞，造成心脑血氧供应不足所致[10]。动脉粥样硬化和斑块不稳定性的主要病理机制为炎症。大多数炎症细胞(如巨噬细胞、肥大细胞等)与细胞因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、C反应蛋白等]相互作用，进而促进动脉粥样硬化斑块去稳定性过程[4]。研究表明M2BP是血浆脂联素的重要配体，可拮抗脂联素对血管内皮细胞炎症损伤的保护作用。另外M2BP还可激活单核细胞和巨噬细胞以促进促炎细胞因子的分泌，这一过程与斑块不稳定性有密切的关系[11]。由此可见，M2BP引起的炎症反应是导致动脉粥样硬化斑块不稳定性的原因之一。本研究通过免疫组化方法检测M2BP主要在人颈动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞中表达，而在平滑肌细胞中甚少表达。此外，M2BP在含有坏死中心的晚期斑块(Ⅱ型)和破裂斑块(Ⅲ型)中的表达比在纤维完整的斑块(Ⅰ型)中的表达高。其机制可能为M2BP激活巨噬细胞，活化的巨噬细胞分泌大量促炎症细胞因子，引起斑块内炎症反应，导致斑块出血溃破，进而血栓形成，最终导致管腔狭窄，甚至闭塞，造成脑缺血，但详细的机制还有待进一步研究。

新生血管形成是晚期斑块的显著特征，斑块内新生血管的特征是血管结构不成熟，导致脂质、红细胞和促炎性白细胞的流入，从而导致斑块内出血、斑块内炎症恶化和斑块不稳定[4]。最近的证据表明，M2BP可通过诱导血管内皮生长因子和刺激内皮细胞管结构形成，进而促进血管生成[12]。因此，可以推断M2BP可能通过促进斑块新血管形成而导致斑块不稳定，但是该假设还需要进一步研究验证。

M2BP是一个分泌蛋白，广泛存在于体液及多种组织中。之前对于M2BP的研究主要集中在M2BP与肿瘤性疾病的关系，其是肿瘤转移和预后的有效生物标记物之一[13]。近期大量研究已经显示M2BP在动脉粥样硬化及冠状动脉疾病中的作用。M2BP与冠状动脉疾病的传统危险因子显著相关，而且可以反映无症状的动脉粥样硬化[8]。此外，血浆M2BP水平还与人颈动脉粥样硬化损伤有显著关联，其也对冠心病患者的全因死亡率和心血管死亡率具有独立的预测价值[11]。本研究也进步证实了这一点，M2BP在有症状的动脉粥样硬化斑块中高表达，特别是在症状严重(TIA和脑卒中)或者症状持续时间较短(<1个月和1~3个月)的斑块中。而且超声检测显示M2BP在无回声斑块和不均质回声斑块中高表达。一般认为，强回声斑块常有纤维化钙化，破裂脱落的几率偏小，故认为其具有稳定性。而低回声和不均质回声斑块比强回声斑块发生心血管病的概率高，由于其易脱落，因此这两种回声的斑块被认为有不稳定倾向[14]。由此可见，M2BP可能有助于颈动脉粥样硬化斑块的发展及不稳定。

斑块内病变细胞死亡是斑块易损性的重要诱发因素。巨噬细胞和平滑肌细胞凋亡是斑块坏死中心扩张和斑块不稳定的主要原因之一[4，15]。平滑肌细胞凋亡增加将导致斑块内基质蛋白沉积减少、纤维帽变薄、斑块炎症加剧和坏死中心扩张[16]。而巨噬细胞凋亡贯穿于整个动脉粥样硬化过程[17]。在动脉粥样硬化晚期，胞葬作用受阻，导致凋亡细胞积聚，继发性坏死以及坏死核心的形成和扩张[4]。本研究结果显示，M2BP阳性表达与巨噬细胞标记物CD68及细胞凋亡呈正相关，与平滑肌细胞标记物α-SMA及胶原蛋白阳性面积呈负相关。胶原蛋白含量的降低是斑块内纤维帽变薄、斑块破裂的主要原因。由此可见，M2BP可能参与斑块内细胞凋亡及纤维帽变薄过程，从而促进斑块不稳定，但确切的证据仍有待进一步研究。本研究也有不足之处，首先人颈动脉斑块的样本量相对较小，也需要病理学研究来验证我们研究的结果。其次，本研究没有探讨M2BP对炎症和细胞凋亡的调节机制，这需要进一步的体外和体内研究加以验证。

4  结论

总之，M2BP在人颈动脉斑块易损区和晚期斑块中高度表达，并且与临床缺血表现显著相关。因此，M2BP可作为斑块去稳定化的重要生物标志物之一。

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(临床和实验医学杂志2019年8月第18卷第16期)

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