人参皂苷Rg3联合紫杉醇抑制人肝癌细胞HepG2增殖和对裸鼠移植瘤模型的作用机制研究

张奉海，张瑞荣，陈淑娟，王金红，于永兰

(山东省日照市莒县中医医院，山东日照276500)

【摘要】目的:探究人参皂苷Rg3联合紫杉醇抑制人肝癌细胞HepG2的增殖，抑制裸鼠移植瘤体内肝脏肿瘤的增长及促进凋亡的作用。方法:体外实验，采用MTT法检测人参皂苷Rg3联合紫杉醇对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用；体内实验，构建人肝癌HepG2细胞裸鼠移植瘤动物模型，随机分为人参皂苷Rg3组，GS-Rg3:10mg/(kg·d)灌胃，紫杉醇组，Taxol:10mg/kg腹腔注射，每周2次，联合组，GS-Rg3+Taxol，给药剂量和方法同上，对照组，灌胃给与等体积生理盐水，共4组，每组10只。连续给药3周，给药结束后颈椎脱臼处死，计算分析各实验组的肿瘤抑制率；WB法检测凋亡蛋白caspase-3、bac-2/bax的表达情况。结果:体外实验结果示，与24h处理组比较，紫杉醇联合人参皂苷Rg3(30、60μg/mL)在48h、72h后对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用显著升高(P<0.05)；与48h处理组比较，紫杉醇联合人参皂苷Rg3(30、60、120μg/mL)在72h后对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用显著升高(P<0.05)。体内试验结果示，给药14d后，人参皂苷Rg3联合紫杉醇组肿瘤抑制率(64.13±2.02)%较人参皂苷Rg3组(48.34±3.86)%和紫杉醇组(54.21±3.21)%显著升高(P<0.05)；给药28d后，联合组肿瘤抑制率(69.38±2.19)%较人参皂苷Rg3组(57.30±3.95)%和紫杉醇组(61.08±4.16)%显著升高(P<0.05)。Westernblot实验结果示，与对照组比较，联合用药组人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤凋亡相关蛋白caspase-3表达显著升高(P<0.05)；联合用药组和紫杉醇组bac-2/bax表达显著降低(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg3联合紫杉醇可通过抑制肝癌细胞的增殖、诱导其凋亡发挥协同抗肿瘤的作用。

【关键词】人参皂苷Rg3；紫杉醇；肝癌细胞；抑瘤率；凋亡

[中图分类号]R285.5  [文献标识码]A  [文章编号]1002-2392(2020)10-0016-04

Mechanism of Ginsenoside Rg3 Combined with Paclitaxel Inhibiting the Proliferation of Human Hepatoma Cell Line HepG2 and Xenograft Tumor in Nude Mice

ZHANG Fenghai，ZHANG Ruirong，CHEN Shujuan，WANG Jinhong，YU Yonglan

(Juxian Hospital of Traditional Chinese Medicine，Rizhao 276500，China)

【Abstract】Objective：To study the effect of ginsenoside Rg3 combined with paclitaxel on inhibiting the proliferation of human hepatoma cell line HepG2，and on inhibiting the growth of transplanted tumor and promoting apoptosis in nude mice.Methods：In vitro experiment，MTT assay was used to detect the inhibitory effect of ginsenoside Rg3 combined with paclitaxel on the proliferation of human hepatoma cell line HepG2.In vivo experiment，the model of human hepato-ma HepG2 cell was established by xenograft method in nude mice.The mice were randomly divided into ginsenoside Rg3 group，GS-Rg3：10mg/(kg·d)，gavage，paclitaxel group，Taxol：10mg/kg，intraperitoneal injection，twice a week，the combined group，GS-Rg3+Taxol，dosage and method as above，and the control group，administered by equal vol-ume of Saline，with 10 mice in each group.After three weeks of intervention，the tumor inhibition rate was calculated and analyzed in each group.Western Blot method was used to detect the expressions of caspase-3 and bac-2/bax.Results：In vitro experiment，it showed that compared to the 24 h treatment group，paclitaxel combined with ginsenoside Rg3(30，60 μg/mL)significantly inhibited the proliferation of human hepatoma cell line HepG2 after 48 h and 72 h of intervention(P<0.05)；72 h of invention showed better results(P<0.05).In vivo test，it showed that after 14 days of intervention，the tumor inhibition rate of the combined group was(64.13±2.02)%，which was significantly higher than(48.34±3.86)% of ginsenoside Rg3 group and(54.21±3.21)% of paclitaxel group(P<0.05).After 28 days of intervention，the tumor inhibition rate was(69.38±2.19)% in the combined group，which was also significantly higher than(57.30±3.95)% in ginsenoside Rg3 group and(61.08±4.16)% in paclitaxel group(P<0.05).West-ern Blot results showed that compared to that in the control group，the expression of caspase-3 was significantly in-creased in the combined group(P<0.05)，and the expression of bac-2/bax was significantly decreased in the com-bined group and in paclitaxel group(P<0.05).Conclusion：Ginsenoside Rg3 combined with paclitaxel can exert syner-gistic anti-tumor effects by inhibiting the proliferation of hepatoma carcinoma cell and inducing apoptosis．

【Key words】Ginsenoside Rg3；Paclitaxel；Hepatoma carcinoma cell；Tumor inhibition rate；Apoptosis

紫杉醇(paclitaxel，Taxol)是从中药红豆杉中提取的抗肿瘤活性成分，在抗肿瘤方面具有显著的疗效[1]，可有效抑制癌细胞的增殖扩散，在多种癌症的治疗上取得了一定的疗效，但是其潜在的不良反应及耐药性使得紫杉醇的使用受到了一定的限制[2]。人参皂苷Rg3(Ginsenoside-Rg3，GS-Rg3)，是从中药人参中提取的单体，国内外许多实验和临床研究发现具有抗肿瘤的作用，目前人参皂苷Rg3对胃癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、大肠癌等肿瘤方面的实验研究较多，但是对于人参皂苷Rg3联合紫杉醇治疗肝癌方面的研究较少[3-5]。

本实验旨在通过人参皂苷Rg3联合紫杉醇抗肝癌的体内外研究，初步探讨两药联合是否具有协同抑制肝癌细胞的作用，为临床应用人参皂苷Rg3联合紫杉醇治疗肝癌提供基础理论及实验依据。

1、材料

1.1主要试剂

人参皂苷Rg3；紫杉醇；DMEM；MTT。

1.2主要仪器

CO2培养箱(Thermo，型号LHH.CP-250-Q)；倒置显微镜(上海精密仪器仪表公司，型号XDS-1A)；H2050R台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；多功能酶标仪(美国Thermo公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；暗盒(上海百研生物科技有限公司)。

1.3动物及细胞株

人肝癌HepG2细胞株(中国科学院生命科学研究所)；无特定病原体(SPF)级BALB/cA-nu裸鼠40只，体质量(100±20)g，购于山东医科大学动物实验中心。

2、方法

2.1细胞的培养

肝癌细胞培养于含10%的胎牛血清的DMEM培养基或1640培养基，并加入1%青霉素和链霉素，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞生长状态，1~2d更换培养基1次，每2~3d加入胰酶进行消化，传代。

2.2人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤

取"2.1"项培养的对数生长期的细胞，在低速离心机(1000r/min，5min)上离心，制成浓度为1×106/mL的混悬液。蘸取碘伏消毒裸鼠右腋下部位，使用1mL一次性无菌注射器抽取0.2mL混悬液注入此处皮下，5~7d内即可触及皮下有结节，2周左右可见肿瘤形成，选择瘤体直径为(65±5)mm的裸鼠移植瘤模型纳入下一步实验。

2.3分组及给药

将造模成功的40只裸鼠随机分为4组：对照组，生理盐水0.2mL，灌胃；人参皂苷Rg3组，GS-Rg3：10mg/(kg·d)，灌胃；紫杉醇组，Taxol：10mg/kg，腹腔注射，每周2次；联合组，GS-Rg3+Taxol，给药剂量和方法同上。每组10只，给药3周后，颈椎脱臼处死，分离瘤体组织。

2.4抑瘤率

取"2.3"项分离的瘤体组织，计算各实验组的肿瘤体积(V)、相对肿瘤体积(RTV)及相对肿瘤抑制率(T/C)。具体计算方式[6]如下：

肿瘤体积(V)=(a×b2)/2

相对肿瘤体积(RTV)=Vt/V0

相对肿瘤抑制率(T/C)=(1-TRTV/CRTV)×100%

其中a为肿瘤的最长直径，b为垂直于a的最短直径；V0为首次给药前的肿瘤体积；Vt为每次测量的体积；TRTV为给药组的相对肿瘤体积；CRTV为对照组的相对肿瘤体积。

2.5MTT检测细胞的增殖

将肝癌细胞随机分为对照组(正常培养)、人参皂苷组(10、20、40、80、100μg/mL)、紫杉醇组(80μg/mL)、联合组给药剂量同上；调整各组细胞至合适浓度，接种于96孔板上，置于培养箱中培养0、24、48、96h后，每孔细胞加入20μLMTT，37℃孵育4h，每孔加入200μLDMSO，置于酶标仪中检测细胞在570nm的吸光值。

2.6Westernblot实验检测细胞凋亡

加入裂解液，提取总蛋白，测定其浓度，并与适量上样缓冲液混合均匀，沸水加热10min，变性；将配置好的聚丙烯酰胺凝胶放入电泳槽，加入电泳液，微量移液器吸取40μg总蛋白加入上样孔中，电泳至蓝色条带分离后调整电压，待蓝色条带到达凝胶底部，切断电源，准备转膜。将PVDF膜浸泡与甲醛中，然后在预冷的电转缓冲液中处理5min，将PVDF膜与凝胶贴合，不要产生气泡，两侧覆盖滤纸，转膜；转膜完毕后将PVDF膜浸泡与5%的脱脂奶粉溶液中，促进非特异性蛋白结合位点封闭；根据抗体说明书稀释抗体，与PVDF膜4℃孵育过夜，37℃水浴复温1h，TBST漂洗2次，每次5min，加入二抗，37℃孵育PVDF膜2h，TBST漂洗2次，每次5min，避光，加入ECL液孵育5min，凝胶成像仪中拍照，QuantityOne分析蛋白质灰度值。

2.7统计学分析

SPSS22.0软件进行统计处理，结果以平均数±标准差(x±s)表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析，组间多重比较使用SNK-q检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。

3、结果

3.1人参皂苷Rg3联合紫杉醇对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用

MTT结果如表1所示，人参皂苷Rg3(10、15、30、60、120μg/mL)联合紫杉醇(80μg/mL)分别处理肝

癌HepG2细胞24、48、72h后，对其增殖作用均有不同程度的抑制作用。与24h处理组比较，紫杉醇联合人参皂苷Rg3(30、60μg/mL)在48、72h后对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用显著升高(P<0.05)；与48h处理组比较，紫杉醇联合人参皂苷Rg3(30、60、120μg/mL)在72h后对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

3.2人参皂苷Rg3联合紫杉醇对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤体内抗肿瘤作用

各实验组小鼠体内肿瘤的生长情况和肿瘤抑制率分别见图1和图2。由图可见，相比于对照组，给予不同药物处理均可抑制小鼠体内肿瘤的生长，其中联合给药组抑制作用最为明显。由图2可以看出，在给药14d后，人参皂苷Rg3联合紫杉醇组肿瘤抑制率(64.13±2.02)%较人参皂苷Rg3组(48.34±3.86)%和紫杉醇组(54.21±3.21)%显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；在给药28d后，联合组肿瘤抑制率(69.38±2.19)%较人参皂苷Rg3组(57.30±3.95)%和紫杉醇组(61.08±4.16)%显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3.3人参皂苷Rg3联合紫杉醇对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤凋亡相关蛋白caspase-3、bac-2/bax表达的影响

Westernblot实验结果如图3所示，从图中可以看出，与对照组比较，联合用药组人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤凋亡相关蛋白caspase-3表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，联合用药组和紫杉醇组bac-2/bax表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

4、讨论

肝癌又称肝恶性肿瘤，是常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌患者死亡率约10万人/年，仅居食管癌和胃癌之后，其年死亡率占全世界肝癌死亡率的45%，如果不及时给予救治，生存期仅0.7~8个月[7-9]。肝癌手术后期的治疗多以放化疗为主，紫杉醇为常见广谱化疗药物[10-11]，与其他化疗药物一样，紫杉醇在用于肝癌治疗过程中，除杀死肝癌细胞外，还会影响机体的正常细胞甚至致其死亡[12-14]。因此，研究更多替代或者辅助化疗的药物，从而起到减毒增效的作用是当下研究的热点问题[15-16]。

本研究选用人参皂苷Rg3联合紫杉醇，通过体内外实验考查其联合肝癌的作用。通过MTT法检测发现两药联合可显著抑制人肝癌细胞HepG2的增殖，与单用紫杉醇相比，其抑制作用更加明显，而抑制肝癌细胞增殖的作用在一定范围内呈现出浓度依赖性关系，当给药浓度超过一定范围时，其抑制作用趋于平稳，这与郑展等人[17]研究的结果一致。此外，通过作用于裸鼠移植瘤肝癌模型，发现随着给药时间的延长，人参皂苷Rg3联合紫杉醇对于体内肿瘤的生长也具有显著的抑制作用。为了从多方面探究两药联合抗肝癌的作用机制，本研究进一步采用Westernblot实验检测肝癌细胞凋亡相关蛋白caspase-3、bcl-2/bax的表达水平，结果显示，联合给药组caspase-3蛋白表达显著升高，bcl-2/bax显著降低，推测人参皂苷Rg3联合紫杉醇可通过caspase-3、bcl-2/bax信号通路诱导肝癌细胞的凋亡。

综上所述，人参皂苷Rg3联合紫杉醇可通过抑制肝癌细胞的增殖和诱导其凋亡达到协同抗肿瘤的效果，但是肝癌的形成、生长、发展和转移机制复杂，不单与肿瘤细胞的增殖、凋亡相关，其他方面的作用还有待进一步研究。

参考文献

[1]张利平，黑江荣，刘华，等.紫杉醇，异环磷酰胺和顺铂新辅助化疗治疗局部晚期宫颈癌的临床疗效[J].现代肿瘤医学，2017，25(17)：2792-2795.

[2]CHOWDHURY P，NAGESH P K，HATAMI E，et al.Tannic acid-in-spired paclitaxel nanoparticles for enhanced anticancer effects in breast cancer cells[J].J colloid interface sci，2019，535(6)：133-148.

[3]买二辉，李四桥，雷霆，等.人参皂苷Rg3联合顺铂对肝癌小鼠体内肿瘤的作用[J].临床与病理杂志，2017，37(11)：2095-6959.

[4]LI L，NI J，LI M，et al.Ginsenoside Rg3 micelles mitigate doxorubicin-induced cardiotoxicity and enhance its anticancer efficacy[J].Drug Deliv，2017，24(1)：1617-1630.

[5]YUAN Z，JIANG H，ZHU X，et al.Ginsenoside Rg3 promotes cytotox-icity of Paclitaxel through inhibiting NF-κB signaling and regulating Bax/Bcl-2 expression on triple-negative breast cancer[J].Biomed Pharmacother，2017，89(6)：227-232.

[6]杨蕾，张振海，贾晓斌.人参稀有皂苷组分联合紫杉醇治疗 A549肺癌的实验研究[J].中国中药杂志，2018，43(7)：1446-1452.

[7]赵东旭.MRI 对老年乙肝肝硬化相关小肝癌患者增强效应的作用分析[J].实用临床医药杂志，2017，21(17)：123-124.

[8]钟国辉，田猛，李开锋，等.普美显增强磁共振与甲胎蛋白结合探讨肝癌相关性的研究现状[J].中国实验诊断学，2019，23(6)：1098-1100.

[9]钱金花，魏美美，宋梦蝶，等.中医药方剂在晚期肝癌患者疼痛减轻和生存期延长方面的作用[J].辽宁中医杂志，2017，44(10)：2111-2114.

[10]LEE J B，YOON S J，LEE S H，et al.Ginsenoside Rg3 ameliorated HFD-induced hepatic steatosis through downregulation of STAT5-PPARγ[J].J Endocrinol，2017，235(3)：223-235.

[11]王国强，苏卓彬，胡瑞霞，等.紫杉醇联合卡铂单周方案与SOX方案用于胃癌新辅助化疗的比较[J].山东医药，2017，57(33)：84-86.

[12]乐可佳，施芳红.抗肿瘤药物不良反应59例[J].医药导报，2017，36(1)：139-141.

[13]申兴勇，徐昕，袁平，等.紫杉醇卡铂联合康莱特对宫颈癌患者血管生成及侵袭能力的影响[J].河北医学，2018，24(12)：2020-2025.

[14]宋婷婷，熊绍权，陈盼，等.参附注射液防治奥沙利铂，紫杉醇化疗所致外周神经毒性回顾性研究[J].中国中西医结合杂志，2019，39(1)：28-32.

[15]闻玉梅.天然免疫与中西医结合[J].中西医结合学报，2004，2(1)：1-2.

[16]江昌，缪雨青，周文丽，等.人参皂苷Rg3的抗肿瘤作用及研究进展[J].临床肿瘤学杂志，2017，22(7)：664-673.

[17]郑展，徐振晔.表皮生长因子受体及其信号转导通路与中西药肿瘤靶向治疗[J].中西医结合学报，2005，3(4)：318-321．

(中医药学报2020年10月第48卷第10期)

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