EGFR和自噬相关蛋白Atg5、p62在宫颈癌中的表达及意义研究

胡红、李循律、黄德旭、陈尧俊、刘春桃、毛毳、陈小兰

【摘要】目的：分析表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)和自噬相关蛋白Atg5、p62在宫颈癌患者中的表达，探讨其与临床病理及预后因素的关系。方法：收集2014年6月至2018年2月收治的80例经病理学证实为宫颈癌患者的组织标本及其癌旁正常组织标本，同时收集上述患者伴有盆腔淋巴结转移组织标本45例。比较宫颈癌组织、转移淋巴结组织和正常组织中EGFR、Atg5、p62表达情况和以上指标与宫颈癌患者临床病理特征及生存情况的关系。结果：EGFR、p62在宫颈癌组织转移淋巴结组织中表达率均明显高于癌旁正常组织(P<0.05)，Atg5在宫颈癌组织中和转移淋巴结组织中表达率分别为21.25%、33.33%，明显低于正常组织(P<0.05)。EGFR表达阳性率与宫颈癌临床病理参数均无相关性(P>0.05)。Atg5、p62在不同年龄及肿瘤直径中的表达差异无统计学意义(P>0.05)，p62表达随肿瘤分化程度升高而降低，不同分化程度间差异有统计学意义(P<0.05)，Atg5在不同肿瘤分化程度间差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴结转移患者中的Atg5表达分别低于Ⅰ+Ⅱ期组和无淋巴转移组(P<0.05)，而p62的表达与之相反。Spearman相关分析显示，宫颈癌组织中Atg5和p62的表达呈明显负相关(r=-0.656，P<0.01)，EGFR与Atg5和p62无相关性(P>0.05)；在转移淋巴结组织中，Atg5和p62的表达呈负相关(r=-0.562，P<0.01)，EGFR与Atg5和p62无明显相关性(P>0.05)。80例患者随访3年死亡22例，3年生存率为72.50%(58/80)，宫颈癌组织中EGFR及p62高表达者3年生存率分别低于EGFR及p62低表达者，而Atg5高表达者3年生存率高于低表达者(P<0.05)。Cox比例风险模型分析显示：TNM分期、淋巴结转移、EGFR、p62为宫颈癌预后的独立危险因素，Atg5 为保护因素。结论：EGFR、p62在宫颈癌组织及淋巴结转移组织中呈高表达，而Atg5呈低表达，三者可作为宫颈癌患者预后独立预测因素，此外，Atg5及p62与宫颈癌生物学行为有关，可能成为宫颈癌诊断的潜在指标。 

【关键词】宫颈癌；淋巴结转移；表皮生长因子受体；自噬；Atg5蛋白；p62蛋白

[中图分类号] R711.74     [文献标识码] A     [文章编号] 1002-7386(2020)18-2760-06 

Expression and clinical significance of EGFR and autophagy-related proteins Atg5 and p62 in cervical cancer

HU Hong，LI Xunlv，HUANG Dexu，et al.

Hospital of People's Government of Tibet Autonomous Region in Chengdu，Sichuan，Chengdu 610000，China

【Abstract】Objective：To investigate the expressions of epidermal growth factor receptor(EGFR)and autophagy- related proteins Atg5 and p62 in patients with cervical cancer，and to explore its correlation between clinicopathological characteristics and prognostic factors.Methods：Eighty cancer tissue specimens and paracancerous tissue in 45 patients with cervical cancer，who were treated in our hospital from June 2014 to February 2018，were collected，at the same time，the 45 specimens of patients with cervical cancer complicated by pelvic cavity lymph node metastasis were collected.The expression levels of EGFR，Atg5 and p62 in cervical carcinoma tissues，metastatic lymph node tissues and normal tissues as well as their correlation with clinicopathological features and survival rate were observed and compared.Results：The expression rates of EGFR and p62 in cervical carcinoma tissues and metastatic lymph node tissues were significantly higher than those in paracancerous tissues(P<0.05)，while the expression rates of Atg5 in cervical carcinoma tissues and metastatic lymph node tissues(21.25%，33.33%)were significantly lower than those in normal tissues(P<0.05).There was no significant correlation between the positive rate of EGFR expression and the clinicopathological parameters of cervical cancer(P>0.05).The expressions of Atg5 and p62 in different ages and tumor diameters were not statistically significant(P>0.05).The expression of p62 changed with that of the degree of tumor differentiation.There were significant differences in differentiation degree(P<0.05)，however，there were no significant differences in the expression of Atg5 in differentiation degrees(P>0.05).Moreover，the expression levels of Atg5 during Ⅲ+Ⅳperiod in patients with lymph node metastasis were significantly lower than those during Ⅰ+Ⅱperiod and those without lymph node metastasis(P<0.05)，but the expression levels of p62 was during Ⅲ+Ⅳ period in patients with lymph node metastasis were significantly higher than those during Ⅰ+Ⅱ period and those without lymph node metastasis(P<0.05).Spearman correlation analysis showed that there was a negative correlation between Atg5 and p62 expression in thyroid cancer tissues(P<0.01)，and there was no significant correlation between EGFR and Atg5 as well as(P>0.05).Among the 80 cases，22 cases died after 3-year follow-up，with the survival rate being 72.50%(P58/80).The 3-year survival rates in patients with higher expression of EGFR and P62 were significantly lower than those of patients with lower expression of EGFR and P62(P<0.05).And the 3-year survival rates in patients with higher expression of Atg5 were significantly higher than those of patients with lower expression of Atg5(P<0.05).In addition，Cox proportional risk model analysis showed that TNM stage，lymph node metastasis，EGFR and p62 were independent risk factors for the prognosis of patients with cervical cancer，however，the Atg5 was the protective factor.Conclusion：GFR and p62 are highly expressed in cervical cancer tissues and lymph node metastasis tissues，however，Atg5 is lowly expressed.The three indexes can be regarded as independent predictors for the prognosis of patients with cervical cancer.In addition，Atg5 and p62 are related with the biological behavior of the patients with cervical cancer，which can be used as potential indicators of prognosis of patients.

【Key words】cervical cancer；lymph node metastasis；epidermal growth factor receptor；autophagy；Atg5 protein；p62 protein

宫颈癌是一种妇科最常见的恶性肿瘤，在发展中国家发病率仅次于乳腺癌，我国发病率位居世界前列并呈年轻化发展趋势，严重影响女性的生命健康[1]。尽管近年来诊疗手段有了很大进展，但由于其容易发生淋巴结转移，预后依然很差[2]。自噬是细胞适应内外部环境变化的能动过程，细胞内部分胞浆、蛋白质和变性坏死的细胞器与自噬泡中的溶酶体融合形成自噬溶酶体，并降解产生氨基酸、核苷酸供细胞再利用的循环过程，也被称为Ⅱ型程序性死亡，属于细胞正常的功能，这一功能在进化过程中高度保守[3]。研究表明，自噬在肿瘤细胞生长、发育、成熟及死亡过程发挥着不同的作用[4]。据报道，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)与肿瘤细胞的发生发展密切相关，在多种实体瘤中呈异常高表达，此外，EGFR通过调节多条信号转导通路参与了细胞自噬的过程[5]。目前自噬与EGFR是否相互作用共同促进宫颈癌的发展尚不清楚，因此本研究拟分析EGFR和自噬相关蛋白Atg5、p62在宫颈癌中的表达，并探讨其临床意义。

1、资料与方法

1.1一般资料 收集2014年6月至2018年2月我院收治的 80 例经病理学证实为宫颈癌患者的组织标本及其癌旁正常组织标本，同时收集上述患者伴有盆腔淋巴结转移组织标本45例。所有入选患者在术前未进行放化疗和其他治疗且3年随访资料完整。80例宫颈癌患者，年龄40~79岁，平均年龄(48.32±12.23)岁；按照国际抗癌联盟TNM分期标准2009版[6]：Ⅰ+Ⅱ期患者39例，Ⅲ+Ⅳ期患者41例；肿瘤直径<1 cm患者35例，≥1cm患者45例；组织学分级：高分化患者26例，中分化患者32例，低分化患者22例。组织标本均在10%中性甲醛中固定，然后常规取材石蜡包埋，用于后续免疫组织化法检测。宫颈癌患者均以电话、门诊等方式进行随访，总生存时间(total survival time)为从手术至随访结束或者死亡时间。

1.2主要抗体与试剂盒 兔抗人EGFR多克隆抗体、兔抗人Atg5单克隆抗体，p62单克隆抗体采购自北京奥维亚生物技术有限公司，链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptomyces anti-biotin protein-peroxidase，SP)试剂盒购自美国Abcam公司，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒采购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3免疫组织化学检测 将石蜡进行切片，放入40% 乙醇中，水浴40℃，4 min，展开，然后置于60℃烘箱中进行烘片。采用二甲苯进行脱蜡20 min，然后采用梯度乙醇水化，加入3%双氧水，室温10 min，从而阻断内源性过氧化物酶的活性，再对EGFR、Atg5、p62蛋白进行高温高压组织修复，磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline，PBS)进行冲洗，加入5%羊血孵育30 min，除去封闭液，加入一抗，置于4℃冰箱过夜，PBS代替一抗作为阴性对照，次日取出使用PBS冲洗，每张切片滴加二抗，室温下孵育30 min，PBS冲洗5次，3 min/次，加入DAB显色水使用PBS冲洗终止显色，使用水冲洗，盐酸乙醇分化，乙醇脱水干燥，进行观察。

1.4EGFR、Atg5和p62阳性判定标准 光学显微镜下观察制备好的切片，阳性表达为胞浆或细胞内出现棕黄色颗粒。由两名病理科医师独立进行评估，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)在光镜下观察，通过染色的强度和阳性细胞数2个总分评分判定是否阳性。染色强度计分：无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄或棕褐色计2分；阳性细胞数计分：无阳性细胞计0分，<25%计1分，25%~50%计2分，51%~75%计3分，>75%计4分，二者结果相乘>3分即为阳性，≤3 分为阴性[7]。

1.5统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，计数资料用百分比表示，采用x2检验或Fisher检验进行分析；等级变量之间的相关性采用Spearman相关分析；采用Graphpad prism5软件绘制生存曲线，生存分析应用Kaplan-Meier方法，Cox回归比例风险模型分析预后影响因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1EGFR、Atg5、p62在不同组织中的表达 宫颈癌组织和转移淋巴结组织EGFR、p62阳性表达率均明显高于正常组织(P<0.05)，而宫颈癌组织和转移淋巴结组织EGFR、p62阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。宫颈癌组织和转移淋巴结组织Atg5阳性表达率明显低于癌旁正常组织(P<0.05)，而宫颈癌组织和转移淋巴结组织Atg5阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图1。

2.2EGFR、Atg5、p62表达与宫颈癌患临床病理参数间的关系 EGFR表达阳性率与宫颈癌临床病理参数均无相关性(P>0.05)；Atg5、p62在不同年龄及肿瘤直径中的表达差异无统计学意义(P>0.05)；p62表达随肿瘤分化程度升高而降低，不同分化程度间差异有统计学意义(P<0.05)，Atg5在不同肿瘤分化程度间差异无统计学意义(P>0.05)；Ⅲ+Ⅳ期组和有淋巴结转移组中的Atg5表达分别低于Ⅰ+Ⅱ期组和无淋巴转移组(P<0.05)，而p62的表达与之相反。见表2。

2.3EGFR、Atg5、p62 的表达相关性分析 Spearman相关分析显示，宫颈癌组织中，Atg5和p62的表达呈负相关(r=-0.656，P<0.01)，EGFR与Atg5和p62无相关性(r=0.042，0.116，P>0.05)；在转移淋巴结组织中，Atg5和p62的表达呈负相关( r =-0.562，P<0.01)，EGFR与Atg5和p6 无相关性(r=0.071，0.136，P>0.05)。

2.4EGFR、Atg5、p62在宫颈癌组织的表达对OS的影响 80例患者随访3年死亡22例，3年生存率为72.50%(58/80)。宫颈癌组织中EGFR及p62高表达者3年生存率分别低于EGFR及p62低表达者，而Atg5高表达者3年生存率高于低表达者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3，图2~4。

2.5宫颈癌患者预后影响的Cox比例风险模型分析 以患者预后的生存情况为因变量，采用Cox比例风险回归模型分析结果显示，TNM分期、淋巴结转移、EGFR、p62为宫颈癌预后的独立危险因素，Atg5为保护因素。见表4。

3、讨论

近年来女性宫颈癌呈现高发且年轻化趋势，且容易发生盆腔淋巴结转移，对患者生命安全造成严重威胁[7]。从良性肿瘤到恶性癌变是动态并连续的过程，研究表明，有多个癌基因及抑癌基因参与了宫颈癌的发生发展，深入探讨相关蛋白的表达有利于进一步明确肿瘤的发病机制，同时可提高临床分子诊断的准确性，有助于改善患者预后[1]。

细胞死亡根据形态学表型不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3种类型，分别指凋亡、自噬性细胞死亡和细胞坏死[8]。自噬广泛存在于细胞的生理活动中，正常细胞通过自噬可以清除胞内废物，维持细胞内环境及基因组的稳定，同时也是一种细胞对抗营养缺乏、电离辐射等不良环境的防御机制，在抑制炎性或肿瘤的生长过程中也起到重要的作用[9]。然而有研究表明，自噬活性受到损伤后对于细胞病变和肿瘤的进展起到促进的作用[10]。微环境决定了自噬在肿瘤发展中的作用，在肿瘤细胞中自噬相关蛋白会出现异常表达，自噬相关蛋白的表达成为研究肿瘤发生及抑制肿瘤发展的热点。

Atg5位于人类染色体6q21，编码276个氨基酸，在自噬相关基因Atg严格调控自噬的过程中起到关键作用，Atg5首先与Atg12结合，形成的Atg5-Atg12泛素样连接系统连接到外膜，自噬体膜延伸，进而形成自噬体，在巨噬细胞中因缺少Atg5而导致吞噬体不能与溶酶体相互融合[11]。有研究表明，Atg5参与多种肿瘤的发生和发展，其中在胃癌、结肠癌和卵巢癌组织中因Atg5基因突变而蛋白表达量降低[12]。本研究发现宫颈癌组织及转移的盆腔淋巴结组织中Atg5的表达率低于正常组织，说明Atg5可能参与宫颈癌的发生发展。TNM分期、淋巴结转移是评估宫颈癌恶性程度的重要指标，本研究结果显示在上述临床病理特征中Atg5的低表达存在明显差异，提示Atg低表达和宫颈癌的生物学行为存在关系；通过进一步生存分析显示：Atg5低表达患者3年生存率明显更低，说明通过检测患者Atg5表达水平能够一定程度上反映宫颈癌患者的预后。同时本研究中Cox比例风险模型结果表明，Atg5低表达和宫颈癌患者预后有良好的关系。

p62是一种自噬底物连接蛋白，具有多个结构域，可结合泛素化修饰的待降解蛋白并将其运输到自噬泡中降解[13]。细胞质中p62在正常细胞自噬过程中不断被降解，而自噬功能出现缺陷或失活后，会导致p62蛋白在细胞质中累积，所以p62可以作为反映细胞自噬活性的标志性蛋白[14]。有研究表明，p62浓度增加会促进活性氧的累积，进而导致细胞内质网发生应激反应和DNA损伤，此外，NF-kB信号通路及下游基因的表达也会受到p62积累的影响而导致促肿瘤炎性反应上调[15]。自噬通过降低细胞内p62的水平是抑制肿瘤形成的机制之一[16]。Beclin1是在哺乳动物中第一个被发现的调节自噬抑癌基因，而p62可使Beclin1和Bcl-2分离，释放出Beclin1而促进自噬活[17]。本研究发现宫颈癌组织及转移的淋巴结组织中p62的表达率高于正常组织，说明p62可能参与宫颈癌的发生发展。进一步分析显示宫颈癌组织中p62随着TNM分期和分化程度的降低而增加，有淋巴结转移患者p62高表达率亦增加明显，说明p62高表达能够间接反映宫颈癌恶性生物学行为。相关性分析结果显示，宫颈癌组织及转移淋巴结组织中p62与Atg5呈负相关，提示二者之间存在一定的联系，可能是肿瘤组织中内环境发生改变后影响指标之间的相互表达。随访结果显示p62高表达患者3年生存率明显低于低表达患者，Cox分析结果显示p62高表达可作为评估宫颈癌预后的独立危险因素。

EGFR是由原癌基因表达，与其配体表皮生长因子、转化生长因子结合后导致细胞内酪氨酸残基发生磷酸化，通过多个信号通路影响细胞生长和凋亡，此外，EGFR酪氨酸激酶能够使Beclin1磷酸化而抑制噬活性，EGFR还可根据其具有的激酶非依赖活性促进细胞存活[18]。研究表明，EGFR在多种实体瘤中均呈高表达状态[19-22]。本研究结果与之类似，在宫颈癌组织和转移淋巴结组织中EGFR表达率高于正常组织，提示EGFR与宫颈癌的发生发展关系密切；进一步结果显示EGFR与研究的宫颈癌患者临床病理学参数均不存在相关性，刘馨等[23]在肺癌患者的研究中发现EGFR与肺癌患者临床病理学参数均无显著相关性，本研究结果与之类似，该结论也可能与纳入的临床样本量较少有关；本研究发现EGFR与自噬相关蛋白Atg5和p62无相关性，可能是由于自噬的调节与EGFR磷酸化水平有关，而总EGFR蛋白表达水平不能反映磷酸化程度而与自噬相关性不显著。但本研究发现EGFR高表达患者3年生存率更低，且可作为宫颈癌患者预后独立预测因素。

综上所述，EGFR、p62在宫颈癌组织及淋巴结转移组织中呈高表达，而Atg5呈低表达，三者可作为宫颈癌患者预后独立预测因素，此外，Atg5及p62与宫颈癌生物学行为有关，可能成为宫颈癌诊断的潜在指标。

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(河北医药2020年9月第42卷第18期)

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