载脂蛋白M在非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭中的作用

王子谨，张晓膺

(苏州大学附属第三医学院心胸外科，江苏常州213003)

【摘要】目的：探讨载脂蛋白M(apoM)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞系增殖、迁移、侵袭的影响及与基质金属蛋白酶(MMP)-10的关系。方法：以转染apoM慢病毒的A549细胞作为实验组(apoM-OE组)，转染空慢病毒的A549细胞作为阴性对照组。分别采用CCK-8法、划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组细胞的增殖、迁移和侵袭能力。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和免疫印迹法检测各组细胞apoM及MMP-10的表达水平。结果：与阴性对照组相比，apoM-OE组apoM表达明显上调(P<0.01)，表达量约为阴性对照组的28倍。apoM-OE组细胞增殖倍数及侵袭率明显高于阴性对照组(P<0.001)。与阴性对照组比较，apoM-OE组空白视野显著减少，闭合速率显著加快，即细胞迁移率更大(P<0.001)。apoM-OE组中MMP-10mRNA及apoM、MMP-10蛋白表达量显著高于阴性对照组(P<0.05)。结论：过表达apoM可增强A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力，同时使细胞高表达MMP-10。

【关键词】载脂蛋白M；基质金属蛋白酶-10；非小细胞肺癌

[中图分类号]R446.1   [文献标志码]A   [文章编号]1673-8640(2020)09-0937-06

Role of apolipoprotein M in the proliferation，migration and invasion of non-small cell lung cancer A549 Cells

WANG Zijin，ZHANG Xiaoying.

(Department of Cardiothoracic Surgery，the Third Affiliated Hospital of Soochow 

University，Changzhou 213003，Jiangsu，China)

【Abstract】Objective：To investigate the influence of apolipoprotein M(apo M)on the proliferation，migration and invasion of non-small cell lung cancer(NSCLC)A549 cell line and its relationship with matrix metalloproteinase(MMP)-10.Methods：A549 cells being transfected with apo M lentivirus were used as apo M-OE group，and those being transfected with A549 empty lentivirus were used as negative control group.CCK-8 method，scratch test and Transwell invasion test were used to determine the proliferation，migration and invasion abilities.The expression levels of apo M and MMP-10 were determined by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR)and immunoblotting.Results：Compared with negative control group，the expression level of apo M in apo M-OE group was up-regulated(P<0.01)，and the expression level was about 28 times higher than that of negative control group.The proliferation and invasion rates of apo M-OE group were higher than those of negative control group(P<0.001).Compared with negative control group，the blank field of vision in apo M-OE group was reduced，the closing rate was accelerated，and the migration rate was greater(P<0.001).The expression levels of MMP-10 mRNA，apo M protein and MMP-10 protein in apo M-OE group were higher than those in negative control group(P<0.05).Conclusions：Over-expressing apo M can promote the proliferation，migration and invasion of A549 cells，and can make the cells highly expressing MMP-10.

【Key words】Apolipoprotein M;Matrix metalloproteinase-10;Non-small cell lung cancer

目前，人类所有癌症中以肺癌的发病率最高，2018年全球新增肺癌病例占所有癌症的11.6%[1]。肺癌也是死亡率最高的癌症，2018年全球肺癌患者死亡例数占全部死亡例数的18.4%[2]。肺癌分为2种组织学亚型：小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC约占所有肺癌的85%，是最主要的肺癌亚型。深入研究肺癌的发生、发展，探寻新的独立标志物对肺癌的诊疗有重大意义。载脂蛋白M(apolipoprotein M，apo M)是1999年被XU等[3]从乳糜微粒中分离并克隆的一种新型载脂蛋白。近年来，有许多研究结果显示，载脂蛋白家族参与了多种肿瘤的发生、发展及预后[4-6]。为此，apo M对NSCLC发生、发展的影响值得进一步研究。另外，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族与肺癌的增殖、侵袭及转移相关[7]，其中MMP-3、MMP-10、MMP-11在NSCLC中过表达[8]，且MMP-10已被证明是NSCLC发生、发展所必需的[9]。本研究旨在探讨apo M对NSCLC A549细胞株增殖、迁移、侵袭能力的影响及其与MMP-10的关系。

1、材料和方法

1.1细胞系和主要试剂

NSCLC A549细胞系购自中国科学院细胞库。Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)购自美国康宁公司。胎牛血清购自美国赛默飞世尔公司。慢病毒包装及相关转染试剂购自上海吉凯基因公司。RNA提取试剂盒(RNAiso Plus Reagent)购自上海申能博彩试剂公司。总蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白定量试剂盒购自上海贝博生物公司。apo M、MMP-10抗体购自英国abcam公司。CCK-8试剂盒购自日本DojinDo公司。CX43型电子显微镜购自日本OLYMPUS公司。DM2500型共聚焦荧光显微镜购自德国Leica公司。

1.2细胞培养及慢病毒转染

将A549细胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养。显微镜下估计细胞密度，当细胞密度为70%时，胰酶消化后重悬细胞，原细胞皿数：传代后细胞皿数按1：5传代继续培养。根据试剂说明书要求进行apo M过表达和空载慢病毒感染。将A549细胞接种于6孔板中(2×105个细胞/mL)，细胞达到50%融合度后，更换含有慢病毒的细胞培养基，并加入慢病毒感染增强液[ENI.S和polybrene，即Polybrene(E)]4 μL，以促进慢病毒转染。成功感染的细胞为绿色荧光蛋白阳性，72 h后在荧光显微镜下观察并使用实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)评估apo M过表达的效率。以转染空慢病毒的细胞作为阴性对照。

1.3qRT-PCR检测

采用Trizol试剂提取总RNA，然后采用MMLV逆转录酶逆转录合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)。使用SYBR Premix Ex Taq试剂(日本TAKARA公司)进行qRT-PCR。循环参数：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。检测仪器为QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪(美国ThermoFisher Scientific公司)。采用2-△△Ct计算mRNA相对表达量。apo M、MMP-10基因及内参基因的引物及探针序列见表1。

1.4采用CCK-8法检测细胞增殖倍数

转染成功24 h后收集细胞，将细胞分为阴性对照组(转染空慢病毒)及apo M-OE组(转染apo M慢病毒)。根据细胞计数结果，用完全培养基将2个组的细胞制成4×104个/mL的细胞悬液。取4块96孔板，每孔加入100 μL制备好的细胞悬液，分别于0、24、48、72 h使用CCK-8法检测apo M-OE组和阴性对照组的细胞增殖倍数。用含10%胎牛血清的DMEM培养基将CCK-8溶液按1：9比例稀释，以此稀释液代替待测孔中的培养基，于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养1~4 h，检测450 nm处的吸光度(A)值，计算细胞增殖倍数。

1.5划痕实验

转染24 h后，在6孔板中接种(2×105个细胞/mL)并孵育48 h，细胞密度达到70%后，用10 μL加样枪枪头在孔板中心轴处划痕过底板，使用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)快速清洗2遍后，加入含1%血清的培养液，于0、24、48、72和96 h取样摄片，记录划痕间距并计算闭合速率。

1.6Transwell细胞侵袭实验

转染成功24 h后收集细胞，将细胞分为阴性对照组(转染空慢病毒)及apo M-OE组(转染apo M慢病毒)。将所有细胞在无血清培养基中培养12 h后消化，PBS清洗2遍，重悬于含10 g/L牛血清白蛋白的无血清培养基中。Transwell细胞侵袭实验在24孔8 mm Transwell板中进行，上室加入1×105个细胞，无血清培养，下室加入10%血清培养基，在37 ℃、5%CO2条件下培养48 h。甲醇固定，结晶紫染色，PBS清洗，在DM2500型共聚焦荧光显微镜下观察并计数。 

1.7免疫印迹法检测细胞apo M和MMP-10相对表达量

收集阴性对照组和apo M-OE组细胞，PBS清洗3次后，使用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，采用BCA法进行定量检测。100 ℃变性5 min后采用10%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)分离30 mg蛋白质样本。将蛋白质转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene flfluoride，PVDF)膜，采用5%BSA 4 ℃封闭过夜后，依次孵育相应的一抗和二抗。最后进行显色并统计灰度值，计算相对表达量。 

1.8  统计学方法

采用GraphPad 5.0软件进行统计分析。所有 实验均独立重复3次。组间比较采用t检验。以 P<0.05为差异有统计学意义。 

2、结果 

2.1apo M-OE组与阴性对照组apo M表达的比较

apo M-OE组和阴性对照组细胞转染情况见图1(a)。与阴性对照组相比，apo M-OE组apo M mRNA相对表达量明显上调(P<0.01)，约为阴性对照组的28倍，见图1(b)。

2.2过表达apo M对A549细胞增殖的影响

转染24及48 h后，apo M-OE组细胞增殖倍数明显高于阴性对照组(P<0.001)；转染72 h时，apo M-OE组增殖速率与阴性对照组一致，推测为细胞增殖过多堆叠所致。见图2。

2.3过表达apo M对A549细胞迁移、侵袭的影响

划痕实验结果显示，与阴性对照组比较，从48 h开始，apo M-OE组A549细胞空白视野显著减少，闭合速率显著加快，即细胞迁移率更大(P<0.001)。见图3。

Transwell细胞侵袭实验结果显示，培养48 h后，apo M-OE组A549细胞侵袭率显著高于阴性对照组(P<0.001)。见图3。

2.4apo M-OE组和阴性对照组细胞中MMP-10的表达

采用qRT-PCR及免疫印迹法检测apo M-OE组和阴性对照组细胞MMP-10 mRNA及蛋白的表达。结果显示，apo M-OE组MMP-10 mRNA及apo M、MMP-10蛋白表达量显著高于阴性对照组(P<0.05)。见图4、图5。

3、讨论

截止到2015年，在我国成年男性中，肺癌的年发病率及年死亡率均居第1位，每年新发病例为73.3万，其中男性为48.9万例；每年约有59.1万例患者死于肺癌，其中男性为40.2万例[10]。由此可见，深入研究肺癌的发生、展，探寻新的独立标志物刻不容缓。有研究结果显示，apo M可能参与了肿瘤的发生、发展[11-12]。JIANG等[11]的研究结果显示，肝癌患者血浆apo M水平高于正常对照组(P<0.01)。

有研究结果显示，肠癌组织中apo M mRNA及蛋白水平明显低于正常组织及良性病变组织(P<0.05)，结直肠癌组织中apo MmRNA表达水平与淋巴结转移有关[12]。由此可见，apo M与肿瘤的发展有关，且在不同肿瘤中表现出促进或抑制作用。本研究结果显示，apo M过表达对A549细胞的增殖、迁移、侵袭能力均表现出促进作用，这提示apo M可能通过某些复杂机制促进NSCLC的发展。

MMP与肿瘤的发展和转移有关。有研究结果显示，MMP-10在NSCLC和经Kras转化的BASC肺癌起始细胞中过表达[13]。体外实验结果显示，MMP-10是NSCLC转化生长及侵袭所必需的[8]。MMP-10在体内实验中也表现出同样重要的作用[13]。

ZHANG等[14]的研究结果显示，与正常组织比较，肺癌组织MMP-10 mRNA水平显著降低(P<0.05)，MMP-10蛋白水平显著升高(P<0.01)。ZHU等[15]的研究结果显示，肺癌组织中apo M mRNA及蛋白水平均显著高于正常组织，apo M可促进A549细胞的增殖和侵袭，其机制为apo M通过上调鞘氨醇-1-磷酸受体-1(sphingosine-1-phosphate receptor-1，S1P1)并激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又称Akt)通路来参与NSCLC的生长调节。PI3K/Akt通路可调节多种转录因子，并参与肿瘤的发生、发展[16]。另外，apo M还可通过与1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)结合等作用参与动脉粥样硬化和炎症刺激等[17]，且MMP-10也与此相关[18]。提示apo M与MMP-10可能存在某种联系。本研究结果显示，过表达apo M的A549细胞中MMP-10 mRNA和蛋白表达明显上调。这提示在A549细胞中，apo M与MMP-10存在联系，并有可能存在复杂的调节机制。

ZHANG等[19]的研究结果显示，IL-6可通过人肺腺癌细胞系中两面神激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/信号传导及转录激活因子-3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)信号通路调节MMP-10的表达。还有研究结果显示，apo M的表达受激素水平、炎性因子及生长因子等诸多因素的调节[20-21]，其与IL-6呈负性调节关系。本研究分别对转染apo M慢病毒的A549细胞和转染空慢病毒的A549细胞进行了细胞增殖实验、细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭实验。结果显示，过表达apo M可促进A549细胞增殖、迁移及侵袭，还可上调MMP-10的表达。但apo M在NSCLC中的作用机制及通路尚待进一步研究。除了本研究进行的apo M过表达研究外，干扰A549细胞中的apo M表达是否会产生影响，apo M对除A549外的其他肺癌细胞系是否具有相似作用，均是下一步研究的目标。另外，后续将对apo M与MMP-10相互作用的信号通路进行研究，包括在过表达apo M的A549细胞中使用MMP-10阻滞剂，观察其细胞功能学改变以及扩大实验对象，采用多种处理因素观察结果等。

综上所述，apo M过表达可促进A549细胞的增殖、迁移和侵袭，并上调A549细胞中MMP-10的表达。

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(检验医学2020年9月第35卷第9期)

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