葛根芩连汤调节慢性胰腺炎外分泌功能实验研究

摘  要

目的：探讨葛根芩连汤是否影响慢性胰腺炎胰腺外分泌功能。方法：采用尾静脉注射二丁基二氯化物诱导大鼠制作慢性胰腺炎（CP） 模型，常规饲养7天后葛根芩连汤组大鼠予1ml/100g葛根芩连汤混悬液（0.4g/ml）灌胃干预，其余两组予同体积蒸馏水，每日1次，连续21天。3周后观察各组大鼠胰腺大体及镜下组织形态改变，测定各组肠道pH值、粪弹力蛋白酶1（FE-1）水平。结果：与对照组比较，模型组大鼠体重及FE-1含量均显著降低（P﹤0.05）；与模型组比较，葛根芩连汤组大鼠体重、肠道内容物pH值、FE-1含量均明显增高（P﹤0.05）。结论：葛根芩连汤中药制剂能通过改变肠道的微环境调节胰腺外分 泌功能，进而影响慢性胰腺炎的预后。

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是一种世界范围内的常见病，其发病机制不明确，病因复杂，最终会导致胰 腺腺泡和胰岛细胞出现不可逆性损害，致胰腺内、外分泌功 能显著障碍，严重影响患者的生活质量。慢性胰腺炎外分泌功能受损后胰酶分泌减少，破坏肠道的微环境，使胃肠道局部的免疫防御机制受损，进而导致肠道细菌菌群失调，同时促使结肠内细菌向末端回肠上移。葛根芩连汤是经典古方之一，近年来对葛根芩连汤治疗代谢性疾病已经有一定的研究，其作用靶点考虑是肠道。该研究以葛根芩连汤灌注慢性胰腺炎大鼠模型，进一步研究葛根芩连汤是否通过 肠道作用影响胰腺外分泌进而影响慢性胰腺炎预后。

材  料

1.1 动物：30只健康雄性Wista大鼠，中国医学科学院辐射 研究所动物中心（中国，证书编号：SCXK［jun］2009-013），体重170～190 g。相对温度20～25℃，相对湿度40%～70%，明暗周期12 h/12 h条件下适应性饲养。

1.2 试剂：二氯二丁基酯 （DBTC，Sigma-Aldrich，美国圣路易斯）；大鼠粪弹力蛋白酶1（Fecal elastase-1，FE-1）酶联免疫吸附试验 （ELISA法）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）。DBTC溶液配制：以7mg/kg计算所需DBTC剂量，以1.75 mg/mL计算溶解剂体积，先将DBTC溶于1/5体积量的无水乙醇中，同时以2∶2混匀甘油与二甲基亚砜，最后将二者混匀。

1.3 仪器：PHS-3c型酸度计（上海三信仪表厂）；722型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；st-360型酶标仪（上海科华生物工程股份有限公司）。

方  法

2.1 分组及造模：按照医用实验动物学实验设计原则，驯化1周后采用直接标号法标号，按随机数表分为正常组、模型组和葛根芩连汤组，每组10只，以尾静脉注射方式进行实验动物造模。模型组及葛根芩连汤组注射二丁基二氯化物（dibutyltindichlo ride，DBTC） 溶液，4 mL/kg，对照组予同体积生理盐水。

2.2 给药方法：各组注射后常规饲养7天，于注射第8天开始灌胃，葛根芩连汤组给予葛根芩连汤混悬液，给药剂量为1mL/100g，模型组及对照组灌注等量蒸馏水，每日1次，连续 28天。葛根芩连汤组成：葛根15 g，黄连、黄芩各9 g，甘草6 g。每剂药共含生药39g，成人按60kg体重计算，参照《医用实 验动物学》，按人与大鼠之间的用药剂量换算，大鼠的剂量（mg/kg）=W（动物与人体的每公斤体重剂量折算系数）×人的剂量（mg/kg），查表得W=6.25，大鼠用药量（g/kg）=6.25×39g/60kg=4g/kg。按照实验动物体质量估算每只大鼠每次用生药0.8g左右，药液浓缩至0.4g/ml，于4℃冷藏保存。灌胃时注意操作轻柔规范，避免损伤实验动物，对动物处理符合2016年我国科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

2.3 取材：连续给药21天后进行样本取材。采用10%水合氯醛（3 ml/kg）行腹腔注射麻醉后解剖。无菌操作取胰腺组织用于病理学检查；取末端回肠内容物用于测定肠道pH 值；收集新鲜粪便约2g，-20℃保存，用于FE-1检测；取材后脱颈法处死。

2.4 指标检测

2.4.1 回肠末端PH变化检测：肠道pH值测定的具体方法是取肠道内容物，按1∶10比例加入去离子水稀释，用小型振荡器振荡混合5 min，混合均匀后用PHS-3c型酸度计测定pH。

2.4.2 粪弹力蛋白酶（FE-1）含量检测：按照ELISA试剂盒说明书所示操作步骤检测。

2.5 统计学方法：使用SPSS 22.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，事后多重检验使用Bonferroni检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。

结 果

3.1 各组大鼠一般情况比较：模型组和葛根芩连汤组在尾静脉注射DBTC溶液后逐渐出现蜷卧萎靡，腹部收缩增加，活动性及反应灵敏度下降，饮食饮水减少，体型较对照组明显偏小，部分大鼠出现呼吸急促，粪质变软，肛周体毛存在 染便情况。其中葛根芩连汤组有3只大鼠于注射后第7天死 亡，开始给药10天后剩余7只大鼠上述症状逐步好转，体型逐渐增大；对照组一般情况无明显异常。实验结束后模型 组大鼠体质量较对照组显著降低，差异具有统计学意义（P﹤0. 001）；葛根芩连汤组大鼠体重较模型组明显增高（P﹤0.05）。见表1。

3.2 各组大鼠胰腺组织变化比较：肉眼下见对照组大鼠胰腺组织色白，形态规整，结构清晰，表面光滑，腺体与胰周各器官组织界限分明，无粘连，胰管未见明显异常改变（图1A）。模型组大鼠胰腺出现不同程度的萎缩，严重者几乎消失，残留实质部分肿胀暗红，表面粗糙，与周边粘连明显，胰管形态不规则，部分扩张（图1B）。葛根芩连汤组胰腺形态欠饱满，表面光滑，胰周无粘连，胰管形态尚规则，无扩张（图1C） 。

3.3 各组大鼠胰腺病理学改变：HE染色镜下对照组胰腺基本结构清楚，形态完好，未见炎性浸润及纤维组织增生（图 2A）。模型组可见炎性细胞浸润及纤维组织交错增生，腺体基本组织结构紊乱，呈网格状，部分腺泡萎缩，胰管扩张（图2B）。葛根芩连汤组可见轻度炎性浸润及纤维组织增生（图2C） 。

3.4 各组大鼠肠道内容物pH值检测：见表2。模型组大鼠肠道内容物pH值有下降趋势（P﹥0.05）；与模型组比较，葛根芩连汤组肠道内容物pH值明显增高（P﹤0.05）。

3.5 各组大鼠FE-1含量比较：见表3。与对照组比较，模型组大鼠FE-1含量显著降低，差异具有统计学意义（P﹤0.05）；葛根芩连汤组大鼠FE-1含量明显高于模型组（P﹤0.05） 。

讨  论

通过检测胰弹力蛋白酶1（Elastase-1，E-1）评价胰腺分泌功能，粪便中E-1的含量要数倍于胰液，在肠道中性质稳定，并且不受口服胰酶制剂的影响，简单易行，研究表明[1]使用ELISA法检测FE-1对轻、中、重度胰腺外分泌不全的敏感度分别为54%、75%和95%，且有荟萃分析表明[2][3]，CP合并PEI时胰酶分泌减少，对蛋白质、脂肪和糖的消化作用及胃酸的中和作用减弱，而肠胰调节使小肠促胰液素、缩胆囊素（CCK）分泌增加；进而使肠道pH下降，相较胰蛋白酶和胰淀粉酶，脂肪酶对pH值变化尤为敏感，pH值降低可抑制脂肪酶的活化[4]，而当pH≤4时脂肪酶即发生变性而被灭活[5]。该研究中模型组肠道内容物pH值有下降趋势（P﹥0.05），考虑可能与CP进展期肠道菌群紊乱后微环境改变及肠道自我修复有关；葛根芩连汤组CP大鼠肠内pH值比模型组显著提高，差异有统计学意义（P﹤0.05），这表明葛根芩连汤可以调节肠道内pH值，有助于维持胰酶活性所需的肠道酸碱环境。葛根芩连汤来自中医经典《伤寒论》，近年来实验研究较为成熟完善地揭示了其药理作用。动物实验[6-7]证实葛根芩连汤对金葡菌、大肠杆菌等多种菌属具有抗菌作用， 并可降低白介素等炎症细胞因子的表达水平，起到抗炎效果，对在体及离体小肠的运动亢进也存在有抑制作用[8][9]葛根芩连汤不仅可以减少炎症因子表达，肠道细菌图谱分析更显示葛根芩连汤增加肠道乳杆菌属的基因表达，揭示其对肠道菌群结构的调节作用，对于使用抗生素导致肠道微生态失衡，葛根芩连汤也可起到积极作用。该实验中葛根芩连汤可缓解CP大鼠外分泌功能不全症状，其机制可能是葛根芩连汤在保护胰腺外分泌功能的同时，通过调节肠道pH值，保持胰酶活性，从而加强了肠道对脂肪等营养物质的消化吸收；并可能与葛根芩连汤抗菌消炎，调整肠道微生态，加强肠道紧密连接，维护肠屏障等作用有关。该研究仅探究了葛根芩连汤对体重、肠道pH值、FE-1含量影响，尚不能完全揭示葛根芩连汤保护胰腺外分泌功能的具体作用机制，此外葛根芩连汤阻止胰腺纤维化的作 用机制尚不清楚，仍待进一步发掘。

参考文献

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[2]Vanga RR，Tansel A，Sidiq S，et al.Diagnostic performance of measurement of fecal elastase-1 in detection of exocrine pancreatic insufficiency：systematic review and meta-analysis ［J］.Clinical Gastroenterology and Hepatology，2018，16 （8） ：1 220-1 228.

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[9]章常华，马广强，邓永兵，等.葛根芩连汤对KK-Ay糖尿病小 鼠血浆中LPS、TNF-α、IL-6及肠道菌群的影响［J］.中草药，2017，48（8）：1611-1616.

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（编号：81503389）；全国名老中医石建华工作室。 

作者简介：贺燕丽，女，主治医师，天津中医药大学第二附属医院（天津300250）；杨朝帅，单位同第一作者。

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